Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Génétique

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

génétique,muscle,pathologies,jonction neuromusculaire,motoneurones,

Keywords

pathologies,muscle,genetics,neuromuscular junction,motor neurons,

Titre de thèse

Modélisation de pathologies neuromusculaires par la co-différenciation dirigée de cellules souches pluripotentes induites en fibres musculaires innervées par des motoneurones
Modeling neurmuscular pathologies by induced pluripotent stem cells directed co-differentiation into muscle fibers innervated by motor neurons

Date

Wednesday 20 May 2020 à 14:00

Adresse

27 boulevard jean Moulin, 13005, Marseille à définir

Jury

Directeur de these M. Frédérique MAGDINIER INSERM U1251
Rapporteur Mme Gillian BUTLER BROWNE institut de myologie
Rapporteur M. Jean Thomas VILLEQUIN CNRS, centre de recherche en myologie
Examinateur Mme Isabelle MARTY Grenoble institut neurosciences
Examinateur M. Nicolas LEVIS INSERM U1251

Résumé de la thèse

Les cellules souches pluripotentes induites humaines (hIPSC) obtenues après reprogrammation de cellules somatiques primaires ont peu à peu révolutionné le domaine de la biologie cellulaire et de la modélisation des maladies grâce à leur capacité infinie d’auto-renouvèlement. Elles représentent donc représente une source inépuisable de matériel biologique pour l’étude du développement et des mécanismes associés à certaines pathologies, avec un accès possible à de nombreux patients pour chacun de ces pathologies. Si les cellules hiPSC ont remarquablement amélioré notre compréhension d’un grand nombre de maladies complexes, la modélisation des pathologies neuromusculaires a jusqu’à présent été ralentie par le manque de protocole efficace et reproductible. Certains des protocoles les plus récents sont basés sur la différenciation dirigée et l’utilisation de petites molécules régulant certaines voies spécifiques. L’utilisation séquentielle de ces molécules permettant l’activation de la voie Wnt et inhibition de la voie BMP par exemple, permet de reproduire les cascades de signaux permettant la différenciation musculaire. Cependant, actuellement aucune méthode ne permet de générer suffisamment de cellules progénitrices musculaires et d’atteindre un niveau de maturité suffisant des fibres musculaires. En effet, bien que plusieurs protocoles de différenciation permettent de produire des cellules musculaires squelettiques à partir de hiPSC, leur stade de différenciation ne dépasse pas le stade fœtal ou leur ultrastructure est peu représentative du tissu in vivo. La création d’un modèle mimant le développement neuromusculaire est donc un enjeu important pour l’étude des pathologies neuromusculaires et du processus précoces de différenciation. Dans cette perspective, nous avons développé un nouveau protocole de différenciation d’hiPSC vers un système neuromusculaire fonctionnel capable de contractions musculaires in vitro. Nos résultats, basés sur la co-différenciation de cellules musculaires et de motoneurones et leur « auto-organisation » ont montré la présence de myosines adultes, de motoneurones matures et de jonctions neuromusculaires. Nos analyses fonctionnelles démontrent l’induction de contractions musculaires répétées sous l’action des motoneurones. La co-différenciation en motoneurones et en cellules musculaires striées squelettiques permet à ce modèle d’atteindre sa maturité en moins d’un mois de différenciation et aux cellules de rester un an, et plus, en culture malgré la persistance des contractions. Ceci peut s’expliquer en particulier par la synthèse d’une matrice extracellulaire et à la présence de précurseurs musculaires PAX7+, qui se maintiennent au cours du temps et permettent une régénération cellulaire autonome. Nos analyses par microscopie électronique ont également montré la présence d’une large organisation structurale en Z du sarcomère, d’un important réseau mitochondrial représentatif des tissus musculaires actifs in vivo et de noyaux localisés en périphérie. L’étude du profil transcriptomique au cours du processus de différenciation a montré que ce modèle permet l’étude de la différenciation musculaire, neuronale et des interactions muscles-neurones de la cellule souches à la fibre musculaire striée adulte. Nous avons démontré et validé la reproductibilité de ce protocole sur le plan moléculaire et fonctionnel, et appliqué cette méthodologie à différentes pathologies dont la dystrophie de Duchenne, la dystrophie facio-scapulo-humérale, la dystrophie myotonique de type 1 et la myopathie des ceintures de type 2A. L’ensemble de ces résultats a mis en évidence le potentiel de ce protocole innovant, ouvrant ainsi la voie à l’exploration approfondie des mécanismes de la différenciation musculaire terminal, à la modélisation des pathologies neuromusculaires, aux criblages moléculaires et à la thérapie cellulaire.

Thesis resume

Until the 2000s, human pluripotent stem cells (hPSC) used in research were of embryonic origin, but thanks to the work of Shinya Yamanaka published in 2007, it is now possible to generate pluripotent stem cells by reexpressing pluripotency genes. Thus, human induced pluripotent stem cells (hIPSC) obtained after reprogramming of primary somatic cells have gradually revolutionized the field of cell biology and disease modeling thanks to their infinite capacity for self-renewal. While hiPS cells have remarkably improved our understanding of a large number of complex diseases, modeling of neuromuscular pathologies has so far been hampered by the lack of an efficient and reproducible protocol. Some of the more recent protocols are based on directed differentiation and the use of small molecules regulating certain specific signaling pathways. The sequential use of these molecules allowing the activation of the Wnt signaling pathway and inhibition of the BMP pathway for example, makes it possible to reproduce the cascades of signals allowing muscle differentiation. However, at present, there is no method which makes it possible to generate sufficient muscle progenitor cells and to reach a sufficient level of maturity of the muscle fibers. Indeed, although several differentiation protocols make it possible to produce skeletal muscle cells from hiPSC, their stage of differentiation does not exceed the fetal stage or their ultrastructure is poorly representative of the tissue in vivo. The creation of a model mimicking neuromuscular development is therefore an important issue for the study of neuromuscular pathologies and the early differentiation process. With this in mind, we have developed a new protocol for differentiating iHPSC towards a functional neuromuscular system capable of muscle contractions in vitro. Our results, based on the co-differentiation of muscle cells and motor neurons and their “self-organization”, showed the presence of adult myosins, mature motor neurons and neuromuscular junctions. Our functional analyzes demonstrate the induction of repeated muscle contractions under the action of motor neurons. Co-differentiation into motor neurons and skeletal striated muscle cells allows this model to reach maturity in less than a month of differentiation and cells to remain a year, and more, in culture despite the persistence of contractions. This can be explained in particular by the synthesis of an extracellular matrix and the presence of PAX7 + muscle precursors, which are maintained over time and allow autonomous cell regeneration. Our electron microscopy analyzes also showed the presence of a broad Z-shaped structure of the sarcomere, a large mitochondrial network representative of active muscle tissue in vivo and nuclei located at the periphery. The study of the transcriptomic profile during the differentiation process has shown that this model allows the study of muscle, neuronal and muscle-neuron interactions from stem cells to adult striated muscle fiber. We have demonstrated and validated the reproducibility of this protocol on the molecular and functional level, and applied this methodology to various pathologies including Duchenne dystrophy, facio-scapulo-humeral dystrophy, type 1 myotonic dystrophy and limbe-girdle muscular dystrophy type 2A. The analysis of our results shows a concordance between the phenotype observed in vitro and that reported in vivo for all of these muscular dystrophies as well as a deregulation in the expression of myogenic genes compared to control. All of these results have highlighted the potential of this innovative protocol, thus opening the way to in-depth exploration of the mechanisms of terminal muscular differentiation, to modeling of neuromuscular pathologies, to molecular screening and to cell therapy.