Soutenance de thèse de Elsa PRUDENT

L’hybridation in situ en fluorescence (FISH) combine les avantages de la biologie moléculaire à l’histochimie et permet de visualiser et d'identifier les pathogènes infectieux directement dans le tissu infecté sans altérer la morphologie cellulaire. Une partie de ce travail de thèse a consisté à appliquer les méthodes de FISH pour l’étude de trois bactéries pathogènes intracellulaires. La viabilité de Bartonella henselae a été évaluée à partir de ganglions de patients atteints de la maladie des griffes du chat. La présence d’ARN n’a pu être mise en évidence par FISH, ces résultats associés aux cultures et analyses histologiques négatives, ainsi qu’au faible taux d’ARN détecté par biologie moléculaire, tendent à confirmer notre hypothèse que ces bactéries ne sont pas ou rarement viables dans les ganglions de patients atteints de la maladie des griffes du chat. Tropheryma whipplei, l’agent de la maladie de Whipple, a été identifié et localisé par FISH dans les macrophages d’un ganglion et d’une biopsie pulmonaire confirmant le diagnostic infectieux. Deux méthodes de FISH ont été testées pour détecter Coxiella burnetii dans des cas d’endocardites et d’infections vasculaires en utilisant des sondes ARN et des sondes PNA. Les résultats ont confirmé une meilleure efficacité des sondes PNA et démontré que les techniques de FISH sont plus sensibles que l’immunohistochimie pour le diagnostic des endocardites et des infections vasculaires à C. burnetii. Nous avons également évalué les stratégies moléculaires mises en place pour le diagnostic syndromique. Bien que la PCR conventionnelle à large spectre permette l'identification de micro-organismes fastidieux et anaérobies, la PCR spécifique en temps réel révèle une supériorité significative dans le diagnostic syndromique. L’ajout de PCR spécifiques en temps réel améliorerait nos protocoles syndromiques comme pour la détection de Staphylococcus aureus dans le diagnostic des adénopathies. En conclusion, le travail fourni tout au long de cette thèse a permis de démontrer l’efficacité et l’applicabilité de la FISH pour le diagnostic des bactéries intracellulaires. Cette méthode peut être utilisée comme un outil complémentaire important, en particulier lorsque les méthodes de routine présentent des divergences de résultats. Le développement et l’optimisation de la FISH et des stratégies syndromiques contribuent à améliorer le diagnostic de microbiologique clinique.

Fluorescence in situ hybridization (FISH) is a unique technique combining molecular biology and histochemical techniques, making it possible to visualize and identify infectious pathogens directly in diseased tissue without altering the cell’s morphology. We applied FISH methods to the study of three intracellular pathogenic bacteria. The viability of Bartonella henselae was evaluated in a large series of lymph nodes from patients with cat scratch disease. B. henselae RNA was not detected by FISH. The results obtained, associated with sterile cultures and negative histological analyzes, as well as the low level of RNA detected by molecular biology, provide evidence that B. henselae are not or are rarely viable in most cases in the lymph nodes of patients with cat scratch disease. Tropheryma whipplei has been identified and localized by FISH in macrophages from one lymph node and for the first time in a pulmonary biopsy, confirming the diagnosis of infection. Two methods of FISH have been tested to detect Coxiella burnetii in cases of endocarditis and vascular infections using RNA and PNA probes. The results attested to the greater efficiency of PNA probes, and demonstrated that FISH techniques were more sensitive than immunohistochemistry for the diagnosis of C. burnetii endocarditis and vascular infections. We also evaluated the molecular strategies used for syndrome-driven diagnosis of infectious diseases. Although conventional broad-spectrum PCR allows for the identification of fastidious and anaerobic microorganisms, real-time specific PCR reveals a significant superiority in syndrome-driven diagnosis. The addition of specific PCRs in real time PCR would improve our molecular strategies, for example, in the case of the detection of Staphylococcus aureus for the diagnosis of lymphadenopathy. In conclusion, this work demonstrates the effectiveness and applicability of FISH for the identification of intracellular bacteria. This method can be used as an important complementary tool, especially when routine methods show discrepant results. The development and optimization of FISH and syndrome-driven strategies contribute to the improvement of clinical microbiological diagnosis.