Soutenance de thèse de STORDER Martin
Titre de thèse
Étude conformationnelle de la protéine SIRPα et recherche d'inhibiteurs modulant son activité
Conformational study of the SIRPα and discovery of inhibitors that modulate its activity
Résumé de la thèse
CD47 est un récepteur d'un point de contrôle immunitaire exprimé de façon ubiquitaire sur la plupart des cellules normales. En se liant à son contre-récepteur inhibiteur SIRPα, exprimé sur les cellules myéloïdes, il transmet un signal qui inhibe la phagocytose et régule négativement la réponse immunitaire innée. Dans de nombreuses pathologies, en particulier certains cancers, les cellules exploitent ce mécanisme en surexprimant CD47, ce qui leur permet d'échapper à l'élimination par les macrophages. Pour contrer cet échappement, des anticorps thérapeutiques anti-CD47 (ou anti-SIRPα) ont été développés et évalués en clinique. Cependant, l'expression ubiquitaire de CD47 entraîne des effets indésirables importants, notamment de l'anémie et d'autres toxicités hématologiques, limitant l'emploi de ces anticorps à fortes doses. Ces contraintes soulignent la nécessité de nouvelles stratégies thérapeutiques plus sélectives et mieux tolérées. Des petites molécules ciblant spécifiquement SIRPα pourraient inhiber la formation du complexe SIRPα-CD47 tout en réduisant la toxicité systémique.
L'inhibition d'une protéine par des petites molécules requiert la présence d'un point d'ancrage tel qu'une cavité mais et ce genre d'élément n'est pas toujours présent dans les interactions protéine-protéine. Pour relever ce défi, nous avons dû approfondir la compréhension de l'interface tridimensionnelle de SIRPα avec CD47 ainsi que son comportement dynamique. Les recherches effectuées ont mené à la découverte d'une poche qui est invisible dans la plupart des structures de SIRPα (poche cryptique). L'occupation de cette poche par certains dérivés indoles permet d'interférer avec la formation du complexe SIRPα-CD47. À partir des molécules de faible affinité pour la poche qui ont été découvertes, une stratégie d'optimisation moléculaire basée sur le lien existant entre structure et activité (SBDD) a été mise en place.
L'accessibilité à la poche cryptique de SIRPα dépend de l'orientation de la chaîne latérale d'un acide aminé particulier, la Glutamine 52 (Q52). Cette dernière peut en effet adopter des conformations qui modulent l'accès à la poche. Le premier objectif de ma thèse a consisté à démontrer le rôle clé de cet acide aminé dans l'accessibilité à la poche cryptique, et à étudier son importance dans la formation du complexe SIRPα-CD47 grâce à des études mutationnelles et fonctionnelles. Les mutations de Q52 induisant un blocage ou une ouverture de la poche sont associées à une diminution d'affinité de SIRPα pour CD47. Ces résultats ont permis de valider l'importance de Q52 pour l'interaction SIRPα-CD47 et notre stratégie d'inhibition basée sur l'occupation de la poche cryptique de SIRPα par des petites molécules pour fixer une conformation de SIRPα incapable de lier CD47.
Les mutants de Q52 induisant une conformation ouverte de la poche cryptique de SIRPα peuvent également constituer des outils facilitant la conception de petites molécules inhibitrices. Dans la seconde partie de ma thèse, j'ai montré que les mutants peuvent moduler l'affinité et l'activité des ligands ciblant la poche. Grâce à ses résultats, nous pouvons considérer la possibilité d'intégrer les mutants au processus de SBDD. Plus largement, cette étude peut servir de preuve de concept pour d'autres protéines disposant d'une poche cryptique et pour lesquelles l'identification de ligands ciblant cette dernière est difficile.
Enfin, mon troisième objectif a été de tester le potentiel d'une autre catégorie de molécules, les peptides macrocycliques, à inhiber la formation du complexe SIRPα-CD47. Au cours de ces études, j'ai identifié et caractérisé plusieurs composés intéressants interagissant directement avec SIRPα. J'ai également confirmé que cette interaction provoque l'inhibition du complexe avec CD47. Bien que le mode d'action des peptides macrocycliques reste à vérifier, notamment par des études structurales, ces composés s'annoncent prometteurs dans le cadre du projet.
Thesis resume
CD47 is an immune checkpoint receptor ubiquitously expressed on most normal cells. By binding to its inhibitory counter-receptor SIRPα, expressed on myeloid cells, it delivers a signal that inhibits phagocytosis and negatively regulates the innate immune response. In many diseases, particularly certain cancers, cells exploit this mechanism by overexpressing CD47, enabling them to escape macrophage-mediated clearance. To counter this escape, therapeutic antibodies targeting CD47 (or SIRPα) have been developed and evaluated clinically. However, the ubiquitous expression of CD47 leads to significant adverse effects, including anemia and other hematological toxicities, which limit the use of these antibodies at high doses. These constraints highlight the need for new therapeutic strategies that are more selective and better tolerated. Small molecules that specifically target SIRPα could disrupt formation of the SIRPα–CD47 complex while reducing systemic toxicity.
Protein inhibition by small molecules typically requires the presence of an anchor point such as a cavity, which is not always present in protein–protein interfaces. To overcome this challenge, we had to deepen our understanding of the three-dimensional SIRPα-CD47 interface as well as its dynamic behavior. Our investigations revealed a pocket that is invisible in most SIRPα structures (a cryptic pocket). Its binding by certain indole derivatives interferes with formation of the SIRPα-CD47 complex. Starting from low-affinity pocket binders, we implemented a structure-based drug design (SBDD) optimization strategy.
Accessibility of the SIRPα cryptic pocket depends on the side-chain orientation of a specific residue, glutamine 52 (Q52), which can adopt conformations that modulate pocket access. The first objective of my thesis was to demonstrate the key role of this residue in cryptic-pocket accessibility and to assess its importance in SIRPα-CD47 complex formation through mutational and functional studies. Q52 mutations that lock the pocket in either a closed or an open state are associated with reduced affinity of SIRPα for CD47. These results validate the importance of Q52 for the SIRPα-CD47 interaction and support our inhibition strategy based on occupying the SIRPα cryptic pocket with small molecules to stabilize a conformation of SIRPα that is unable to bind CD47.
Q52 mutants that favor an open conformation of the cryptic pocket can also serve as tools to facilitate the design of small-molecule inhibitors. In the second part of my thesis, I showed that such mutants can modulate the affinity and activity of ligands targeting the pocket. These findings support the integration of mutants into the SBDD process. More broadly, this study provides a proof of concept for other proteins harboring cryptic pockets for which the identification of ligands is challenging.
Finally, my third objective was to assess the potential of another class of molecules, macrocyclic peptides, to inhibit formation of the SIRPα-CD47 complex. In these studies, I identified and characterized several promising compounds that interact directly with SIRPα, and confirmed that this interaction inhibits complex formation with CD47. Although the mechanism of action of the macrocyclic peptides remains to be fully elucidated, particularly through structural studies, these compounds appear promising within the context of the project.