Soutenance de thèse de Hamza OLLEIK

L’infection gastrique par Helicobacter pylori (bactérie à Gram négatif) touchant plus de 50 % des humains est la seconde cause d’infection bactérienne dans le Monde après les carries. A long terme, les complications causées par cette infection (ulcères et cancers) sont responsables de plus de 700,000 décès par an dans le Monde. Les antibiotiques “conventionnels” utilisés en médecine ont permis de traiter les patients infectés par H. pylori. Malheureusement, comme dans le cas de nombreuses bactéries, cette utilisation d’antibiotiques a provoqué l’apparition de souches résistantes aux traitements responsables d’échecs thérapeutiques observés chez 20-30 % des patients. L’augmentation constante de l’incidence de souches d’H. pylori résistantes a motivée la recherche de nouvelles molecules ayant comme caractéristiques: i) d’être actives contre H. pylori, notamment les souches déjà résistantes aux antibiotiques conventionnels, ii) d’être peu ou pas toxiques et iii) de ne pas causer / sélectionner de résistance. Durant ma thèse, plusieurs molécules naturelles ou synthétiques pouvant remplir ces critères ont été évaluées. La première piste explorée a été celle de molécules issues des plantes: les Aurones et les Berbérines. Les résultats présentés dans cette thèse démontrent le potentiel de ces molécules avec des concentrations minimales inhibitrices (CMI) faibles et une toxicité modérée à l’encontre des cellules gastriques humaines (CMI de 3.12 µM et index thérapeutique de 16 pour les meilleurs composes). La seconde piste suivie a été celle de peptides antimicrobiens (PAM) issus de champignons (les cyclodepsipeptides de type Enniatine et Beauvericine), de grenouilles (Temporine SHa et ses dérivés) ou d’estomac de vache (les Lynronnes). Les PAM ont un mécanisme d’action original qui consiste à s’attaquer directement à la membrane des bactéries entrainant très rapidement leur mort par dépolarisation et/ou perméabilisation membranaire, contrairement aux antibiotiques conventionnels qui eux ciblent des enzymes intracellulaires. Les résultats présentés dans cette thèse ont confirmés qu’à l’exception des cyclodepsipeptides fongiques présentant une toxicité élevée, les PAM représentaient une bonne piste dans l’éradication d’H. pylori. Ainsi, les temporines et les Lynronnes présentent de très bonnes valeurs de CMI contre H. pylori (1.5 à 12.5 µM) y compris contre les souches d’H. pylori isolées de patients et résistantes aux antibiotiques conventionnels. L’utilisation de cellules et d’explants gastriques humains a permis de montrer que ces PAM sont peu ou pas toxiques à l’encontre de l’estomac, donnant des indices thérapeutiques pouvant être supérieur à 1000 pour les meilleurs composés. Même si la temporine SHa et les Lynronnes conservent leur activité en présence de mucus gastrique et au pH acide de l’estomac, ces peptides sont inactivés par la pepsine, une protéase présente dans l’estomac. Des dérivés résistants à la pepsine ont donc ensuite été synthétisés en modifiant spécifiquement les acides aminés de série L situés aux sites de coupure par la pepsine par des acides aminés de la série D. De manière intéressante, alors que dans le cas de la temporine SHa ce changement de conformation des acides amines au site de coupure pepsique entraine une perte d’activité, les Lynronnes modifiées conservent leur activité, faisant de ces molécules de très bons candidats pour une utilisation in vivo. En conclusion, mes résultats montrent que plusieurs pistes suivies durant ma thèse peuvent être considérées comme prometteuses dans l’éradication d’H. pylori, particulièrement celle des PAM de type Temporine SHa et Lynronnes qui sont peu toxiques et actifs même contre les souches résistantes aux antibiotiques conventionnels responsables d’échecs thérapeutiques.

Helicobacter pylori, a gram-negative bacterium infecting the stomach, is the second cause of bacterial infection (after caries) in the world with 50 % of the human beings chronically infected. Long term infection by H. pylori leads to gastric ulcer and eventually to gastric cancer, with around 700,000 deaths per year. Although antibiotics were successfully used to treat patients, they are also responsible for the selection of resistant strains accounting for the 20-30 % treatment failure observed. For that reason, new molecules should be considered to treat H. pylori, ideally ones that are: i) active on H. pylori, including strains already resistant to conventional antibiotics, ii) not or poorly toxic and iii) not able to cause significant resistance. Few options were considered during my thesis that we thought could fulfill those purposes. The first option was chemical derivatives of the plant molecules Aurones and Berberines. The derivatives showed potent inhibition of H. pylori (Minimal Inhibitory Concentration (MIC) of 3.12 µM for the best molecules) and moderate toxicity against human gastric cells giving good therapeutic index (around 16). Mechanistic studies showed that these molecules act mainly by inhibiting the biosynthesis of macromolecules of the bacteria. The second option considered was antimicrobial peptides (AMP) originated from fungi (cyclodepsipeptides such as Enniatins and Beauvericin), from frog’s skin (Temporin-SHa and its derivatives), or present in the stomach of cow (Lynronnes). Due to their unique mechanism of action relying on the targeting of the bacterial membrane, they could be considered as good candidates. Results were promising with good activity – toxicity profile for Temporins and Lynronnes, but not for cyclodepsipeptides that showed no activity against H. pylori and high toxicity against human gastric cells. Both Temporins and Lynronnes gave very good MIC values (as low as 1.5 µM for the best molecule) against H. pylori, including clinical strains resistant to antibiotics. In addition, Temporins and Lynronnes caused low toxicity to human gastric cells and tissues with therapeutic indexes superior to 1,000 for the best compound (i.e. Lynronnes). Although Temporins and Lynronnes were not affected by the presence of gastric mucus, they were partially (for NST-1, a derivative of Temporin-SHa) or totally inactivated (i.e. Temporin-SHa and Lynronnes) due to digestion by the gastric protease pepsin, limiting their use in vivo. Pepsin-resistant version of Temporin-SHa and Lynronnes were thus designed by changing the conformation from L to D of the amino acids recognized by pepsin. Surprisingly, whereas such modification totally suppressed the antibacterial activity of Temporin-SHa, it did not affect the activity of Lynronnes. Importantly, since only pepsin’s cleavage sites were modified, pepsin-resistant Lynronnes were still sensitive to digestion by other intestinal proteases such as trypsin. This will theoretically allow their inactivation before they can reach the colon, limiting their impact on the commensal microbiota and making pepsin-resistant Lynronnes specific of H. pylori contrary to conventional antibiotics. Mechanistic approaches demonstrated that only Temporin-SHa and its active analogs insert into lipids of H. pylori and form pores whereas Lynronnes do not form pores at concentrations closed to the MIC. Time kill assay confirmed the difference of mechanism of action of Temporin-SHa and Lynronnes with Temporin-SHa and its derivative NST-1 being able to kill 90-100 % of bacteria in 5-20 min whereas Lynronnes acted similarly to the conventional antibiotic amoxicillin causing around 30 % killing after 180 min. Taken together, my results demonstrated that among the different options we tested to treat H. pylori, Temporin-SHa and Lynronnes are the best candidates, particularly in the case of resistant strains responsible for treatment failure.