Soutenance de thèse de Sidiky MENIL

Les enzymes sont de remarquables outils pour réaliser des réactions de synthèse dans des conditions respectueuses de l’environnement. Une attention croissante est maintenant portée à l’élaboration de voie de synthèses multienzymatiques en cascade pour élaborer des procédés de synthèse plus efficaces. Cependant, dans les procédés in cellulo, le contrôle de l’expression hétérologue de plusieurs gènes dans un même hôte s’avère souvent difficile et peut mener à des déséquilibres du flux réactionnel. Pour exploiter au mieux les avantages d’une cascade de réactions, il est donc nécessaire d’ajuster les activités de chaque étape, c’est-à-dire de construire des biocatalyseurs cellulaires capables de programmer la stœchiométrie des enzymes de la cascade. Nous avons développé dans ce projet une approche originale pour moduler la stœchiométrie d’enzymes in cellulo en jouant sur le nombre de copies de plasmides par cellule (PCN). Ce paramètre est régulé dans la cellule bactérienne par trois principaux mécanismes menant, selon le réplicon, à des plasmides à faible, moyen et haut nombre de copies. Comme preuve de concept nous avons choisi un système autosuffisant « neutre – redox » associant une Alcool Déshydrogénase (ADH) et une Baeyer-Villiger MonoOxygenase (BVMO), toutes deux NADP(H)-dépendantes. Plusieurs plasmides recombinants portant les deux gènes ont été construits puis associés de manière combinatoire dans la bactérie E. coli. Les souches de co-expressions ainsi conçues ont été testées et comparées en terme de nombre de copies de plasmides par cellule, de concentration en gène, de production d’enzymes et d’activité. Nous avons montré l’importance d’un choix judicieux de la combinaison de plasmides ainsi que l’existence d’une corrélation entre ratios enzymatiques et activité globale. Nos biocatalyseurs s’étendent sur une gamme allant du système totalement inactif à un système affichant, après une première optimisation, un TTN de l’ordre de 6000. Ce système a permis, entre autres, la synthèse de deux lactones d’intérêt industriel, la dihydrocoumarine-3,4 et epsilone-caprolactone, via une double oxydation de l’indanol et du cyclohexanol. Enfin, sur ce modèle de combinaison de plasmides, trois nouveaux biocatalyseurs cellulaires, associant l’ADH à diverses BVMOs, ont été créés et expérimentés afin d’élargir la gamme d’esters et de lactones pouvant être obtenus à partir d’alcools. En résumé, cette approche a permis la construction de biocatalyseurs plus efficaces adaptés à la synthèse de lactones ou d’esters.

Enzymes are outstanding tools to perform synthetic reactions under environmentally friendly conditions. Growing attention is currently paid to the design of multi-enzymatic cascades to develop synthetic processes more efficient. However, in the in cellulo processes, the control of the simultaneous heterologous expression of several genes in the same host is often difficult and can lead to imbalances in the reaction flow. To exploit the benefits of cascade reactions, the activities of each step have to be adjusted. To reach this goal, whole-cell biocatalysts capable of programming the stoichiometry of the cascade enzymes have to be constructed. In this project, we developed an original approach to modulate in cellulo the stoichiometry of cascade enzymes. We postulated that the enzyme ratio could be tuned playing with the number of plasmid copies per cell (PCN). This number is regulated in the bacterial cell by three main mechanisms leading, according to the replicon, to low, medium and high copy number plasmids. As proof of concept, we chose a self-sufficient "neutral-redox" system combining an Alcohol Dehydrogenase (ADH) and a Baeyer-Villiger MonoOxygenase (BVMO), both NADP(H)-dependent. Several recombinant plasmids harboring both genes were constructed and then combinatorically transformed in the bacteria E. coli. The co-expression strains thus designed were tested and compared in terms of plasmid copy number per cell (quantified by qPCR), gene concentration, enzyme production and system activity. We showed the importance of a judicious choice of the plasmid combination as well as the existence of a correlation between enzymatic ratios and overall activity. Our biocatalysts ranged from an inactive system to a system displaying, after a first optimization, a TTN of the order of 6000. This system allowed, among others, the synthesis of two lactones of industrial interest, 3,4-dihydrocoumarin and epsilon-caprolactone, via a double oxidation of indanol and cyclohexanol. Finally, based on this plasmid combination model, three new whole-cell biocatalysts, combining ADH with various BVMOs, were designed and experimented to broaden the range of esters and lactones synthesizable from alcohols. In summary, this approach allowed the construction of more effective biocatalysts for the synthesis of esters or lactones starting from alcohol.