Soutenance de thèse de ZEHNACKER Steven
Titre de thèse
interactions picochlorum–virus : une fenêtre sur la photosynthèse et la voie de dégradation de l'hème
picochlorum–virus interactions: a window into photosynthesis and heme degradation pathway
Résumé de la thèse
Une collection de grands virus à ADN double brin à récemment été détectée dans une culture de la microalgues méditerranéenne, Picochlorum (Chlorophytes, Trebouxiophyceae). Le suivi métagénomique de la culture montre que ces virus (putatifs Picochlorovirus) possèdent des gènes typiques des Phycodnaviridae, présentent une diversité génétique remarquable et abritent des gènes métaboliques auxiliaires (AMG), notamment l'hème oxygénase 1 (HMOX1) et la phycocyanobiline : ferrédoxine oxydoréductase (PcyA). Ces enzymes contribuent au métabolisme des bilines dans le chloroplaste et se sont révélées essentielles à la croissance photoautotrophe et à l'acclimatation à la lumière chez Chlamydomonas reinhardtii (Chlorophyte, Chlorophyceae). Les analyses bio-informatiques ont confirmé la spécificité virale des deux AMGs et la conservation de leurs résidus catalytiques. Afin d'étudier leur fonction, des protéines virales HMOX1 et PcyA ont été produites dans E. coli pour des études in vitro, parallèlement à des homologues de Picochlorum et C. reinhardtii utilisés comme témoins. Conformément aux protocoles de tests d'activité enzymatique de C. reinhardtii, vHMOX1 et PicoHMOX1 fonctionnent de manière similaire à leur homologue C. reinhardtii, catalysant la formation de biliverdine. Les tests de bilines réductases révèlent que PicoPcyA et vPcyA produisent plus d'intermédiaires réactionnels que de produits finaux, contrairement à leur homologue C. reinhardtii, qui synthétise la phycocyanobiline. Cela peut s'expliquer soit par une activité enzymatique différente entre les homologues C. reinhardtii et les enzymes virales et Picochlorum, soit par le fait que ces protéines fonctionnent dans un environnement différent ou avec d'autres cofacteurs. Il s'agit du premier rapport faisant état de la présence de tels AMGs dans des virus infectant vraisemblablement un hôte eucaryote. Cette découverte justifie la poursuite des recherches afin de déterminer si ces enzymes conservent une activité partielle, interfèrent avec la fonction des protéines endogènes ou entrent en compétition avec les substrats des enzymes de l'hôte. Afin d'élucider leur rôle, des expériences in vivo ont été lancées sur C. reinhardtii, Picochlorum et E. coli et sont toujours en cours afin de confirmer la production des bilines par les enzymes virales dans un environnement cellulaire. Nous avons également isolé l'hôte Picochlorum du bassin de culture d'origine où l'infection virale s'est produite, afin d'étudier ses caractéristiques photosynthétiques. Nous avons procédé à une caractérisation physiologique et biophysique, notamment du taux de croissance, de la teneur en pigments, du Fv/Fm, du taux relatif de transport d'électrons (rETR), du rapport PSI/PSII et de l'extinction (quenching) non photochimique (NPQ). Puis nous avons comparé les données à deux autres souches de Picochlorum : P. celeri et son mutant STR30843 (qui ne possède pas de complexes antennaires LHCII). Les résultats indiquent que Picochlorum possède un appareil photosynthétique hautement adaptable, basé principalement sur l'activation de mécanismes photoprotecteurs plutôt que sur une augmentation de l'activité photosynthétique. Cette caractérisation fournit une base précieuse pour de futures études sur l'impact de l'infection par le Picochlorovirus sur la photosynthèse de l'hôte, que nous avons l'intention d'étudier après la mise en place d'un pathosystème stable en laboratoire.
Thesis resume
A collection of large double-stranded DNA viruses has recently been detected in a culture of the Mediterranean microalgae, Picochlorum (Chlorophytes, Trebouxiophyceae). Metagenomic survey of the culture shows that these viruses (putative Picochloroviruses) have typical Phycodnaviridae genes, exhibit remarkable genetic diversity and harbor auxiliary metabolic genes (AMGs), including Heme oxygenase 1 (HMOX1) and Phycocyanobilin:Ferredoxin Oxidoreductase (PcyA). These enzymes contribute to bilin metabolism in the chloroplast and have been shown essential for photoautotrophic growth and light acclimation in Chlamydomonas reinhardtii (Chlorophyte, Chlorophyceae). Bioinformatic analyses confirmed the viral specificity of the two AMGs and the conservation of their catalytic residues. To study their function, the viral HMOX1 and PcyA proteins were produced in E. coli for in vitro studies, alongside homologs from Picochlorum and C. reinhardtii used as controls. According to the enzymatic activity testing protocols of C. reinhardtii, vHMOX1 and PicoHMOX1 function similarly to their C. reinhardtii homolog, catalysing the formation of biliverdin. Bilin reductase assays revealed that PicoPcyA and vPcyA produce more reaction intermediates than final products, unlike their C. reinhardtii homolog, which synthesizes phycocyanobilin. This may be explained either by a different enzymatic activity between the C. reinhardtii homolog and the viral and Picochlorum enzymes, or by the fact that these proteins operate in a different environment or with other cofactors. This is the first report of such AMGs in viruses putatively infecting eukaryotic hosts. This finding warrants further investigation into whether these enzymes retain partial activity, interfere with native protein function, or compete for the substrates of endogenous enzymes. To elucidate their role, in vivo experiments were initiated in C.reinhardtii, Picochlorum and E.coli and are still under development to confirm bilin production in a cellular environment. We also isolated the host Picochlorum from the original culture basin where the viral infection occurred, to study its photosynthetic characteristics. We performed physiological and biophysical characterization—including growth rate, pigment content, Fv/Fm, relative electron transport rate (rETR), PSI/PSII ratio, and non-photochemical quenching (NPQ)—and compared the data to two other Picochlorum strains: P. celeri and its mutant STR30843 (which lacks LHCII antenna complexes). Results indicate that Picochlorum possesses a highly adaptable photosynthetic apparatus mainly based on the activation of photoprotective mechanisms rather than an increase in photosynthetic activity. This characterization provides a valuable foundation for future studies on the impact of Picochlorovirus infection on the host photosynthesis, which we aim to investigate following the establishment of a stable laboratory pathosystem.