Soutenance de thèse de MOM Jérémy
Titre de thèse
Analyse structure/fonction du pilus de compétence, une nanomachine filamenteuse répandue, dédiée à la capture d'ADN chez les bactéries monodermes
Structure/function analysis of the Com pilus, a widespread filamentous nanomachine dedicated to DNA uptake in monoderm bacteria
Résumé de la thèse
Les filaments de type 4 (FT4) constituent une vaste superfamille d'appendices extracellulaires ubiquitaires chez les procaryotes, impliqués dans une grande diversité de fonctions telles que l'adhésion aux surfaces, l'agrégation des cellules, la motilité, la sécrétion de protéines ou encore la capture d'ADN. Ces filaments sont assemblés par des nanomachines multiprotéiques complexes qui ont invariablement en commun les quatre protéines cœurs spécifiques. Les filaments sont ainsi des polymères de pilines de type 4, qui sont maturées par une prépiline peptidase. L'assemblage du pilus est orchestré par une protéine de plateforme, énergisée par une ATPase d'extension. Au cours de ma thèse, je me suis intéressé au pilus de compétence Com, un FT4 exclusivement dédié à la transformation naturelle des bactéries monodermes, peu étudié, mais pourtant très largement répandu. Pour étudier ce pilus, j'ai utilisé Streptococcus sanguinis, un monoderme qui a récemment émergé comme modèle pour l'étude des FT4. Cette bactérie motile et naturellement compétente est une commensale de la cavité buccale humaine et un pathogène opportuniste capable de causer des endocardites.
Dans un premier temps, j'ai réalisé une analyse fonctionnelle systématique des huit gènes com connus pour être impliqués dans la compétence médiée par le pilus Com. J'ai établi que ces huit gènes sont essentiels à la fois pour l'assemblage d'un long filament et pour la transformation naturelle. J'ai également démontré que le pilus Com est composé de la piline majeure ComGC et de quatre pilines mineures qui forment un complexe au sommet du pilus. La construction d'une souche exprimant constitutivement ces huit gènes a permis de montrer que les protéines correspondantes sont nécessaires et suffisantes pour l'assemblage du pilus Com. Cela a permis de démontrer expérimentalement pour la première fois que les quatre composés cœurs conservés chez tous les FT4 constituent un système minimaliste pour l'assemblage des FT4. Dans un second temps, j'ai décrypté les mécanismes moléculaires de la capture d'ADN par le pilus Com, en utilisant une approche structure/fonction menée exclusivement in vivo. J'ai pu montrer que la capture d'ADN repose sur une interface formée par deux pilines mineures ComGD et ComGF, dont j'ai confirmé l'existence au sein du pilus, par une approche de pontage par cystéines. Ce mode de capture d'ADN, différent de ceux décrits auparavant chez les FT4, serait conservé chez toutes les bactéries monodermes compétentes.
Mot clés : filament de type 4, pilus de compétence, machinerie minimaliste, capture de l'ADN, piline mineure
Thesis resume
Type 4 filaments (T4F) constitute a large superfamily of extracellular appendages that are ubiquitous in prokaryotes and involved in a wide variety of functions such as surface adhesion, cell aggregation, motility, protein secretion and DNA uptake. These filaments are assembled by complex multiprotein machinery that invariably share four specific core proteins. The filaments are thus polymers of type 4 pili, which are matured by a prepilin peptidase. Pilus assembly is orchestrated by a platform protein, energised by an extension ATPase. During my thesis, I focused on the Com competence pilus, an T4F exclusively dedicated to the natural transformation of monoderm bacteria, which has been little studied but is nevertheless very widespread. To study this pilus, I used Streptococcus sanguinis, a monoderm that has recently emerged as a model for the study of FT4s. This motile and naturally competent bacterium is a commensal of the human oral cavity and an opportunistic pathogen capable of causing endocarditis.
First, I performed a systematic functional analysis of the eight com genes known to be involved in Com pilus-mediated competence. I established that these eight genes are essential for both long filament assembly and natural transformation. I also demonstrated that the Com pilus is composed of the major pilin ComGC and four minor pilins that form a complex at the tip of the pilus. The construction of a strain constitutively expressing these eight genes showed that the corresponding proteins are necessary and sufficient for Com pilus assembly. This provided the first experimental evidence that the four core components conserved in all FT4s constitute a minimal system for FT4 assembly. Secondly, I deciphered the molecular mechanisms of DNA capture by the Com pilus, using a structure/function approach conducted exclusively in vivo. I was able to show that DNA capture relies on an interface formed by two minor pilins, ComGD and ComGF, whose existence within the pilus I confirmed using a cysteine cross link approach. This mode of DNA capture, which differs from those previously described in FT4, appears to be conserved in all competent monoderm bacteria.
Keywords: type 4 filament, competence pilus, minimalist machinery, DNA capture, minor pilin