Soutenance de thèse de GROS Alice
Titre de thèse
Etude quantitative de la variabilité morphogénétique d'organoïdes embryonnaires
Quantitative analysis of morphogenesis variability in embryonic organoids
Résumé de la thèse
Le développement embryonnaire précoce des mammifères reste largement méconnu, car l'embryon se forme à l'intérieur de l'utérus maternel, ce qui pose d'importants problèmes d'ordre éthique et technique. Pour contourner cette limitation, des travaux récents ont montré que les cellules souches embryonnaires peuvent s'agréger et s'auto-organiser in vitro en tissus structurés qui présentent des similarités avec l'embryon de souris post-implantation, au moment de la gastrulation. Nous nous concentrons en particulier sur les modèles appelés gastuloïdes, dérivées de cellules souches embryonnaires de souris.
Ces systèmes multicellulaires évoluent d'un agrégat sphérique homogène de cellules souches vers un tissu 3D qui brise sa symétrie, sur le plan morphologique (allongement de la forme) et génétique (polarisation de l'expression génetique). Au cours du développement, des hétérogénéités apparaissent : à l'échelle tissulaire, des gradients d'expression génétique et de propriétés physiques se forment ; à l'échelle cellulaire, des cellules voisines développent des profils d'expression différents et s'assemblent en amas dotés d'une microstructure distincte. Dans ce travail doctoral, j'ai étudié avec des approches expérimentales et computationnelles l'apparition de ces hétérogénéités et leur contribution à la brisure de symétrie.
Cependant, la géométrie tridimensionnelle des gastruloïdes et la forte densité de cellules freinent l'imagerie en profondeur et la quantification des processus à l'échelle cellulaire. De plus, les expériences et analyses doivent être menées à haut débit pour capturer la variabilité du développement.
Pour répondre à cette problématique, j'ai élaboré un pipeline pour l'analyse 3D multi-échelle intégrant imagerie, traitement d'image et quantification des propriétés tissulaires. Ce pipeline combine l'imagerie biphoton multicolore de gastruloïdes entiers imagés depuis des vues opposées pour augmenter la profondeur de l'acquisition, avec le traitement et le recalage d'images bidirectionnelle. La segmentation 3D des noyaux par apprentissage profond nous permet de mesurer leur forme et de quantifier l'expression génétique à l'échelle de la cellule. À partir des images traitées, des cartes de corrélation entre différents gènes et propriétés cellulaires/tissulaires (déformation des noyaux, densité de divisions et de cellules) caractérisent les hétérogénéités spatiales. Ce pipeline haute-débit me permet de quantifier l'interaction entre l'expression génétique et les propriétés physiques aux échelles cellulaires et tissulaires durant le développement des gastruloïdes.
J'ai ensuite examiné le rôle des divisions cellulaires dans la brisure de symétrie en testant deux hypothèses : (i) une croissance anisotrope entre populations cellulaires favoriserait l'allongement ou la polarisation du tissu, et (ii) des divisions orientées contribueraient à l'allongement du tissu. J'ai comparé les gradients de prolifération aux gradients d'expression génétique, sur échantillons vivants et fixés.
Enfin, j'ai analysé l'émergence de motifs de déformation nucléaire et des hétérogénéités du tissu (densité cellulaire, taille et déformation des noyaux, ordre nématique) au cours du développement, déterminant quand des compartiments aux propriétés physiques distinctes émergent et comment le tissu acquiert sa structure.
Grâce à des outils expérimentaux et computationnels, cette étude établit les gastruloïdes comme un modèle pertinent pour quantifier l'organisation tissulaire à partir de cellules pluripotentes homogènes et approfondir notre compréhension du développement précoce des mammifères.
Thesis resume
The early mammal development remains largely unknown because embryos at this stage develop inside the mother's uterus, creating significant technical and ethical challenges for their study. To overcome this limitation, recent studies have demonstrated that embryonic stem cells can aggregate and self-organize in vitro into structured tissues resembling the post-implantation embryo during gastrulation. In particular, we focus on models known as gastruloids, which are derived from mouse embryonic stem cells.
These multicellular systems develops from a spherical and homogeneous stem cells aggregate into a 3D tissue that breaks its symmetry in morphology (tissue elongation) and gene expression (tissue polarization). During development, heterogeneities arise both at the tissue scale with gradients of gene expression and physical properties, and at the cellular scale, where neighbouring cells exhibit different gene expression profiles and assemble into clusters with a distinct microstructure. In this doctoral work, I investigated—using both experimental and computational approaches—when developmental heterogeneities emerge and how they contribute to symmetry breaking.
However, the three-dimensional geometry and high cell packing of gastruloids hinder deep imaging and quantification of cell-scale processes. Moreover, the experiments and analysis must be performed at high-throughput to capture the variability of the development.
To address this challenge, I developed a pipeline for 3D multiscale analysis that integrates imaging, image processing and quantification of tissue properties. The pipeline combines multicolor two-photon imaging of whole-mount gastruloids acquired from opposite sides to increase imaging depth, with pre-processing and registration of the dual-view images. Deep-learning based 3D segmentation of the nuclei allows us to measure their shapes and to quantify cell-scale gene expression. From the processed images, correlation maps between different genes and cell/tissue properties (nuclei deformation, division density, tissue packing fraction) characterize spatial heterogeneities. Together, this high-throughput pipeline allows me to quantify how gene expression interplays with physical properties across scales during gastruloid development.
I then investigate the role of cell divisions during symmetry breaking, testing two hypotheses: (i) anisotropic growth between different cell populations participate in tissue elongation or polarization, and (ii) oriented cell divisions contribute to tissue elongation. I compared proliferation gradients with gene expression gradients in live and fixed approaches comparatively.
Finally, I investigated the emergence of nuclei deformation patterns and heterogeneities in tissue properties (cell density, nuclei size, nuclei deformation, orientational nematic order) during the development. I analyzed computationally when compartments with distinct physical properties emerge and how the tissue acquires its structure.
Through the development of experimental and computational tools, this study establishes gastruloids as a relevant model for quantifying the emergence of tissue organization from homogeneous pluripotent cells and for deepening our understanding of early mammal development.