Soutenance de thèse de MELISSA PETITI

Le système Tol-Pal est un complexe macromoléculaire hautement conservé chez les bactéries à Gram négatif. Cette machinerie multi-protéique et trans-enveloppe est impliquée dans deux aspects critiques de la vie cellulaire : l'intégrité membranaire et la division cellulaire. Il est composé de cinq partenaires : les protéines TolQ, TolR et TolA forment un complexe de membrane interne, et la lipoprotéine Pal ancrée à la membrane externe interagit avec la protéine périplasmique TolB et le peptidoglycane. De manière intéressante, une interaction PMF et TolQR-dépendante a été mise en évidence entre les protéines TolA et Pal, permettant ainsi au complexe Tol-Pal de relier membrane interne et membrane externe. Les protéines TolQ et TolR forment un complexe qui appartient à la famille des moteurs moléculaires. Cette hypothèse est étayée par les nombreuses homologies que le complexe partage avec les moteurs Mot et Ton respectivement impliqués dans la rotation du flagelle bactérien et le transport actif du fer. Les travaux décrits dans ce manuscrit de thèse portent à la fois sur l’aspect moteur moléculaire et sur l’implication du complexe lors de la division cellulaire. En effet, un modèle d’organisation des segments transmembranaires qui constituent le moteur TolQR a été proposé précédemment, dans lequel les protéines TolQ et TolR formeraient un canal ionique dans la membrane interne. Notre travail s’est alors concentré sur les trois protéines transmembranaires TolQ, TolR et TolA dans le but de confirmer et préciser ce modèle. A l’aide d’une approche par « cysteine scanning », nous avons montré des interactions directes entre TolQ et TolR, ainsi qu’entre les domaines périplasmiques des protéines TolA et TolR. En identifiant les résidus impliqués dans ces interactions, nous avons pu affiner notre modèle d’assemblage du complexe de membrane interne TolQRA. Dans un deuxième temps, nous nous sommes intéressés au processus de division cellulaire au cours duquel le système Tol-Pal intervient. Afin de comprendre comment cette machinerie opère chez E. coli, nous avons initié une approche systématique de microscopie à fluorescence. Nous avons montré d’une part que le complexe Tol-Pal est localisé au septum lors de la division cellulaire et d’autre part que la PMF est requise pour la localisation septale de la lipoprotéine Pal. L’ensemble de nos travaux permettent une meilleure compréhension du fonctionnement de la machinerie et notamment de sa dynamique en réponse à l’utilisation de la PMF comme source d’énergie.

The Tol-Pal system is a macromolecular complex highly conserved in Gram-negative bacteria. This multiprotein and trans-envelope machinery is involved in two critical aspects of cell life: the outer membrane integrity and the process of cell division. It is composed of five partners: TolQ, TolR and TolA form an inner membrane complex, and the lipoprotein Pal is anchored to the outer membrane and interact with the peptidoglycan and the periplasmic protein TolB. Interestingly, a TolA-Pal interaction can connect both inner and outer membranes, and has been shown to be PMF and TolQR-dependent. The TolQR proteins form a complex which is part of the molecular motor family and this hypothesis is supported by the several homologies shared with the Mot and Ton system, respectively involved in flagella rotation and iron intake. The work described in this thesis manuscript concern both the molecular motor aspect and the cell division process. Indeed, an organization model of the transmembrane helices of E. coli TolQ and TolR has been proposed previously, in which the TolQR protein form an ionic channel in the inner membrane. Firstly, our work focused on the three inner membrane proteins TolQ, TolR and TolA in order to confirm and specify this model. With a cysteine scanning approach, we showed direct physical interactions between TolQ and TolR. By identifying the amino acids involved in these interactions, we were able to refine our model about the TolQRA inner membrane complex assembly. Secondly, we focused our work on the cell division process in which the Tol-Pal is involved. We initiated a systematic fluorescence microscopy approach to understand how this machinery operates in E. coli. On one hand, we showed that the Tol-Pal machinery is recruited to cell septum during cell division, and on the other hand that PMF is required to allow the lipoprotein Pal septal localization. Overall, these results provide a better comprehension on the Tol-Pal machinery mechanism and particularly its dynamic in response to the use of PMF as source energy.