Soutenance de thèse de ZAKARIAN Stéphane
Titre de thèse
Mécanismes réactionnels de la formiate déshydrogénase ForCE1: une approche intégrée par spectroscopie, DFT et dynamique moléculaire
Reaction mechanisms of formate dehydrogenase ForCE1: an integrated approach using spectroscopy, DFT and molecular dynamics
Résumé de la thèse
Les formiate déshydrogénases (FDH) catalysent la réaction HCOO-⇄CO2+2e-+2H+. A ce jour, leurs mécanismes moléculaires restent encore mal compris, notamment le mécanisme catalytique et la résistance à l'oxygène. Face à la grande diversité de cette famille d'enzymes et au nombre limité de systèmes caractérisés, l'exploration de nouvelles FDHs apparait comme une approche prometteuse pour approfondir notre compréhension de ces enzymes.
La bactérie du sol Bacillus subtilis possède deux FDHs, ForCE1 et ForCE2, qui interviennent dans la chaine respiratoire aérobie et appartiennent à une nouvelle sous-famille de FDH. La structure de ForCE1, déterminée par cryo-microscopie électronique et diffraction des rayons X, révèle une organisation atypique. En particulier, la sous unité catalytique ForC se distingue par un site actif non-consensuel, un site de fixation pour une ménaquinone et une interaction avec un module partenaire inédit, ForE, qui sert de conduit pour les quinones.
Mon projet de thèse se concentre sur deux volets principaux : d'une part, le mécanisme catalytique d'oxydation du formiate et de réduction du CO2 des FDHs, et d'autre part, le cycle des quinones dans ForCE1.
A partir de l'analyse de séquences des FDHs et des structures disponibles, j'ai démontré qu'il semble n'exister qu'un seul tunnel conservé pour l'accès au site actif, permettant dans la majorité des cas le transport à la fois du formiate et du CO2. Mes analyses ont révélé que la mobilité d'un résidu His/Gln à l'extrémité de ce tunnel régule l'accès au site actif, et que sa conformation est contrôlée par l'établissement de liaisons hydrogènes avec les résidus voisins. Sur le plan mécanistique, j'ai étudié les relations entre la géométrie de la première sphère de coordination du métal au site actif et le biais catalytique. Les résultats indiquent notamment qu'une certaine orientation du ligand protéique pourrait défavoriser la réaction de réduction du CO2. Le site actif a été caractérisé en détail par spectroscopie RPE. J'ai également analysé un variant où la Gln392 du site actif est remplacée par le résidu His, conservé dans d'autres FDHs. Mes résultats sont interprétés à la lumière des mécanismes réactionnels proposés dans la littérature.
En ce qui concerne les quinones, j'ai d'une part confirmé que l'interaction du complexe ForCE1 avec la membrane via le domaine appelé HMP (helical membrane plug-in) est indispensable à l'échange de quinones entre ForCE1 et la membrane. D'autre part, j'ai caractérisé le mode de fixation de l'intermédiaire ménasemiquinone dans son site Q en étudiant ses interactions magnétiques avec les noyaux voisins.
En conclusion, mes travaux apportent un nouvel éclairage sur la mécanistiques de la famille FDH.
Thesis resume
Formate dehydrogenases (FDH) catalyse the reaction HCOO-⇄CO2+2e-+2H+. To date, their molecular mechanism remains not well understood, particularly the catalytic mechanism and oxygen resistance. Given the great diversity of this family of enzymes and the limited number of characterised systems, the exploration of new FDHs appears to be a promising approach for furthering our understanding of these enzymes.
The soil bacterium Bacillus subtilis possesses two FDHs, ForCE1 and ForCE2, which are involved in the aerobic respiratory chain and belong to a new FDH subfamily. The structure of ForCE1 resolved by cryo-electron microscopy and X ray diffraction reveal an atypical organisation. In particular, the ForC catalytic subunit features a non-consensual active site, a menaquinone binding site and an interaction with an original partner module, ForE, which acts as a channel for quinones.
My thesis project focuses on two mains topics: firstly, the catalytic mechanism of formate oxidation and CO2 reduction, and secondly, the quinone cycle in ForCE1.
From sequence analysis of FDHs and available structures, I have shown there appears to be only one conserved tunnel for access to the active site, allowing in most cases the transport of both formate and CO2.
My analyses revealed that the mobility of a His/Gln residue at the end of this tunnel regulates access to the active site, and that its conformation is controlled by the establishment of hydrogen bonds with neighbouring residues. Mechanistically, I studied the relationship between the geometry of the metal first coordination sphere at the active site and catalytic bias. In particular, the results indicate that a certain orientation of the protein ligand may disadvantage the CO2 reduction reaction. The active site has been characterised in detail using EPR spectroscopy. I have also analysed the variant in which the Gln392 of the active site is substituted by the His residue, conserved in other FDHs. My results are interpreted in the light of the reaction mechanisms proposed in the literature.
Regarding the quinones, I have confirmed that the interaction of ForCE1 complex with the membrane via the HMP domain (helical membrane plug-in) is essential for the exchange of quinones between ForCE1 and the membrane. In addition, I have characterised the binding mode of the menasemiquinone intermediates in its Q site by studying its magnetic interactions with neighbouring nuclei.
In conclusion, my work sheds new light on the mechanistic of the FDH family.