Soutenance de thèse de COTTEN Aurélie
Titre de thèse
Etude du potentiel neurorégénérateur de la protéine c5a du complément
Study of the neuroregenerative potential of complement c5a protein
Résumé de la thèse
Les lésions traumatiques du système nerveux central demeurent sans solution thérapeutique efficace pour restaurer les fonctions perdues. En effet, les axones lésés ne sont pas en mesure de repousser spontanément et de se reconnecter à leurs cibles d'origine en raison d'un environnement défavorable. Récemment, la protéine C5a du Complément, connue pour son rôle important dans l'inflammation, est aussi impliquée la régénérescence tissulaire via son récepteur C5aR. Par ailleurs, cette protéine combinée à un biomatériau à base de collagène permet la régénérescence du complexe pulpo-dentaire. Ainsi, ce travail étudie l'efficacité thérapeutique du C5a sur la régénérescence axonale à la suite d'une axotomie réalisée in vitro ainsi que la survie et le développement neuronale lorsqu'il est associé à une matrice à base de collagène.
Des neurones hippocampiques primaires, isolés à partir d'embryon de rats (E18) Wistar, ont été mis en culture et caractérisés par immunofluorescence. Après une lésion traumatique, l'expression de l'ARNm du C5a et du C5aR a été évaluée par RT-PCR et la sécrétion de C5a quantifiée par dosage ELISA. L'activation du C5aR a été étudiée par immunofluorescence. L'effet du C5a sur la régénérescence axonale a été évalué dans un dispositif microfluidique. La biocompatibilité du support de collagène avec C5a a été validée par test MTT et la libération du C5a, quantifiée par dosage ELISA. Enfin, l'adhésion et la croissance des neurones ont été visualisées avec le kit Live/Dead et le recrutement cellulaire dans le support a été analysé par immunomarquage.
Les résultats montrent que les neurones matures expriment le C5aR et sécrètent du C5a de manière constitutive. L'ajout de C5a stimule la vitesse et la croissance axonale. Le support de collagène est non toxique et favorise l'adhésion neuronal dans le matériau après 7 jours. Ces résultats révèlent un nouveau rôle du C5a dans la régénérescence axonale, offrant une perspective prometteuse pour traiter les lésions traumatiques du système nerveux central avec perte de substance.
Thesis resume
Spinal cord injury is considered as a degenerative disease with no effective therapy to restore the lost functions. In this thesis we investigated the effects of the Complement C5a protein, which plays a significant role in regulating the inflammation and regeneration of numerous tissues upon binding to its receptor, the C5aR. Our laboratory has developed a collagen scaffold combined with C5a and demonstrated its effects on the regulation of dental pulp inflammation and regeneration. The aim of this study is to investigate the effect of C5a on injured axonal growth in vitro.
Primary hippocampal neurons were isolated from embryonic Wistar Rats. A traumatic injury was simulated, and C5a effects were analyzed using fluorescence microscopy. In this injury model, C5aR mRNA expression was investigated by RT-PCR, C5a secretion was quantified by ELISA while C5aR localization and phosphorylation were studied by immunostaining. The effect of C5a concentration on axonal growth was studied using a microfluidic device. The biocompatibility of collagen scaffold containing C5a was studied by MTT assay while C5a release from the support was quantified by ELISA. Finally, neuronal adhesion and growth length were visualized using the Live/Dead kit, and cell recruitment within the regenerative support was analyzed by immunofluorescence.
The primary cultures contained mainly mature neurons expressing C5aR at their membranes. This culture was found to constitutively secrete C5a. Adding C5a led to a phosphorylation of C5aR and an increased axonal length and stimulation of axonal growth speed. Finally, the scaffold was not toxic, and cell recruitment and adhesion were observed within the scaffold after 7 days.
Our findings highlight a new role of C5a in regeneration demonstrating an enhancement of axonal growth after axotomy. This may provide a promising therapeutic tool for the treatment of spinal cord injury.