Soutenance de thèse de Thi Trang Nhung TRINH

Ecole Doctorale
Sciences de la Vie et de la Santé
Spécialité
Biologie-Santé - Spécialité Biochimie structurale
établissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
système de sécrétion,T9SS,T2SS,bactérie Gram négative,
Keywords
secretion system,T9SS,T2SS,Gram-negative bacteria,
Titre de thèse
Etudes structurale des système de sécrétion de type IX et de type II
Structural studies of type IX and type II secretion systems
Date
Jeudi 21 Mars 2019
Adresse
Campus de Luminy, Case 932 163, avenue de Luminy 13288 MARSEILLE Cedex 09, France
Amphi 12
Jury
Directeur de these M. Alain ROUSSEL Architecture et Fonction des Macromolécules Biologiques (AFMB), CNRS-UMR 7257
Rapporteur Mme Andrea DESSEN Institut de Biologie Structurale
Rapporteur M. Herman VAN TILBEURGH Institut de Biologie Intégrative de la Cellule
Examinateur Mme Nathalie COLLOC'H ISTCT -  CNRS - UNICAEN - CEA
Examinateur M. Hervé DARBON AFMB
CoDirecteur de these M. Christian CAMBILLAU AFMB

Résumé de la thèse

Les protéines synthétisées et sécrétées par les bactéries jouent des rôles importants pour leur survie. En particulier, les bactéries à Gram négatif ont développé des voies de sécrétion en tant qu'armes principales pour transporter des facteurs de virulence dans l'environnement extracellulaire ou dans des cellules hôte. L'un de ces systèmes, le système de sécrétion de type IX (T9SS), également appelé système de sécrétion Por, est exclusivement présent dans le superphylum Fibrobacteres-Chlorobi-Bacteroidetes (groupe CFB). Le T9SS a été principalement étudié chez l'agent pathogène oral Porphyromonas gingivalis et chez la bactérie mobile Flavobacterium johnsoniae. Le T9SS est composé de 10 à 14 protéines qui forment une nanomachine complexe couvrant les deux membranes cellulaires. Un autre complexe sophistiqué, le système de sécrétion de type II (T2SS), largement disséminé dans les bactéries didermes, est le principal déterminant de la virulence de la bactérie Pseudomonas aeruginosa, un agent pathogène de la fibrose kystique. Le T2SS comprend 12 protéines différentes. Ces deux systèmes de sécrétion fonctionnent selon un mécanisme en deux étapes, dans lequel les protéines substrats sont d'abord exportées à travers la membrane cytoplamique de Sec ou Tat dépendante, puis sont recrutées et sécrétées à travers la membrane externe. Dans le cadre de ma thèse, j'ai résolu la structure atomique de plusieurs composants centraux du T9SS et du T2SS. Concernant le projet T9SS, j'ai essayé de cristalliser le domaine péripalsmique de PorM de P. gingivalis et le domaine cytoplasmique de GldL de F. johnsoniae, deux composants essentiels pour la sécrétion. Cependant, je n'ai pas réussi à obtenir des cristaux diffractants. En parallèle, des anticorps monoclonaux de lama, également appelés nanobody (Nb), ont été obtenus contre GldL. La co-cristallisation de GldL avec des Nbs a été réalisée sans succès. Néanmoins, les structures cristallines de deux nanobody contre GldL ont été résolues par remplacement moléculaire, l’une d’elles présentant une conformation inhabituelle avec un échange de domaine au niveau du CDR3 et du C-terminus qui aboutit à la formation d’un dimère entrelacé (manuscrit en préparation). De plus, j'ai également travaillé sur la protéine périplasmique PG1058 de P. gingivalis. J'ai obtenu des cristaux du domaine de type OmpA_C de PG1058 qui diffractaient jusqu'à 1,55 Å et j'ai résolu sa structure par diffraction anomale à la longueur d’onde du selenium. Un petit fragment de peptidoglycane ainsi que des ions sodium étaient visibles dans la carte de densité électronique (manuscrit en préparation). En ce qui concerne le projet T2SS, je me suis concentré sur la partie N-terminale de XcpQ, une sous-unité de la sécrétine, composée de quatre sous-domaines (N0-N3). J'ai résolu la structure cristalline de XcpQN012 seul et en complexe avec le nanobody vhh04 à une résolution de 2,98 Å et de 2,9 Å, respectivement. Ce travail a été publié dans l'American Society for Microbiology, avec les résultats d'expériences de coloration négative et de tests in vivo et in vitro obtenus par nos collaborateurs de l’IMM. Enfin, j'ai participé à la détermination structurale de TssK, un composant de plaque de base du système de sécrétion de type VI (T6SS). J'ai produit et cristallisé le domaine C-terminal de TssK, ce qui a permi de résoudre sa structure à une résolution de 1,61 Å. Ce résultat combiné avec les résultats sur la structure cristalline de TssK complet et les tests in vivo et in vitro obtenus par nos collaborateurs de l’IMM a été publié dans le journal Nature Microbiology. Finalament, j'ai réussi à déterminer la structure cristalline d'un nanobody (vhh19) contre le domaine périplasmique de PorM, qui a été publiée dans un article dans le journal Acta Crystallography F, avec trois autres structures de nanobody résolus dans l’équipe. Ces deux articles sont présentés dans la section annexe.

Thesis resume

Proteins synthesized and secreted by bacteria serve many important roles in their survival. In particular, Gram-negative bacteria have evolved secretion pathways as the main weapons for transporting virulence factors into target cells or into the extracellular environment. One of these systems, the type IX secretion system (T9SS), also known as the Por secretion system, is exclusively present in the Fibrobacteres-Chlorobi-Bacteroidetes superphylum (CFB group). T9SS has been studied mainly in the oral pathogen Porphyromonas gingivalis and the gliding bacterium Flavobacterium johnsoniae. T9SS is composed of 10-14 proteins that form a complex nanomachine which spans the two cell membranes. Another sophisticated complex, the type II secretion system (T2SS), widely distributed in diderma bacteria, is the main determinant of the virulence of Pseudomonas aeruginosa, a cystic fibrosis pathogen. T2SS comprises 12 different proteins. Both two systems operate a two step mechanism, in which the cargo proteins are first exported through the cytoplamic membrane by Sec or Tat-dependent passage, and then recruited and secreted across the outer membrane. In my PhD thesis, I solved the atomic structure of several core components of both T9SS and T2SS. For the T9SS project, I tried to crystallize the peripalsmic domain of PorM from P. gingivalis and the cytoplasmic domain of GldL from F. johnsoniae, two essential components of the T9SS. However, I failed to obtain diffracting crystals. In parallel, llama monoclonal antibodies, also called nanobodies (Nb), were raised against GldL. The co-crystallization of GldL with Nbs was unsuccessfull. Nevertheless, the crystal structures of two nanobodies against GldL were solved by molecular replacement, one of thoem showing an unusal conformation with a domain swapping in the CDR3 and the C-terminus that results in the formation of an intertwined dimer (manuscript in preparation). In addition, I also worked on the periplasmic PG1058 protein of P. gingivalis. I obtained crystals of the selenomethionine-derivatized PG1058 OmpA_C-like domain that diffracted up to 1.55 Å, and solved its structure by single-wavelength anomalous diffraction. A short fragment of peptidoglycan as well as sodium cations were visible in the electron density map (manuscript in preparation). For the T2SS project, I focussed on the N-terminal part of XcpQ, a subunit of the secretin, which is composed of four subdomains (N0-N3). I solved the crystal structure of XcpQN012 alone and in complex with nanobody vhh04 at a resolution of 2.98 Å and 2.9 Å, respectively. This work has been published in American Society for Microbiology, along with results from negative-stain EM experiments, in vivo assays and in vitro cysteine cross-linking obtained by co-workers from IMM. In addition, I took part in the structural determination of the base plate component TssK of the Type VI secretion system (T6SS). I produced and crystallized the C-terminal domain of TssK, which allowed to solve its structure at a resolution of 1.61 Å. This result combined with all the results obtained on the crystal structure of the full-length TssK and in vivo and in vitro assays from our collaborators, was published in Nature Microbiology. Finally, I was able to determine the crystal structure of one nanobody (vhh19) against the periplasmic domain of PorM, which was published in a paper in Acta Crystallography F, along with three other nanobodies structure obtained in the team. These two papers are presented in the appendix section.