Soutenance de thèse de XIE WANG

Les écosystèmes sont riches de microorganismes qui ont la capacité de s’adapter à des conditions extrêmes. Acidithiobacillus ferrooxidans, une bactérie à gram négatif, est le modèle bactérien le plus étudié et le plus pertinent pour comprendre comment survivre en milieu acide à des pH aussi bas que pH 2. La compréhension fondamentale des mécanismes permettant à la bactérie d’acquérir l’énergie nécessaire à sa croissance en couplant l’oxydation du fer ferreux, trouve un écho dans le domaine plus appliqué de biolixiviation. Plusieurs métalloprotéines ont été identifiées et caractérisées d’un point de vue biochimique, en particulier deux cytochromes dihémiques et une cuprédoxine. Cependant, la voie de transfert d’électron couplant l’oxydation du fer ferreux à la réduction de l’oxygène depuis la membrane externe jusqu’à la membrane interne n’est pas élucidée. Au cours de ce travail de thèse, nous avons reconstitué à l’interface électrochimique une partie de la chaîne respiratoire d’A. ferrooxidans dans le but de déterminer étape par étape le chemin de transfert d’électrons. Notre attention s’est portée sur trois protéines qui interagissent dans la chaîne respiratoire: la cytochrome c oxidase (CcO), une cuprédoxine nouvellement identifiée au laboratoire (AcoP), ancrée à la membrane, qui copurifie avec la CcO mais de fonction inconnue, et un cytochrome dihémique (Cyt c4) proposé comme interagissant avec la CcO. La stratégie que nous avons développée est d’étudier ces trois protéines seules ou incubées deux à deux sur diverses interfaces électrochimiques. L’idée sous jacente est de mimer un des partenaires par une fonctionnalisation adéquate de l’électrode. Au-delà des données thermodynamiques pour chacune des protéines isolées, cette stratégie offre la possibilité de déterminer les bases moléculaires des interactions protéine-protéine favorables au transfert d’électron. La mise en évidence puis la quantification d’un transfert d’électron intermoléculaire entre le cytc4 et AcoP, et entre le cytc4 et la CcO nous a permis de proposer un rôle pour AcoP et un nouveau chemin de transfer d’électron vers la CcO. Nous avons ensuite étudié les propriétés électrochimiques de la CcO vis à vis de la réduction catalytique de O2. Nous avons en particulier mis en évidence la forte affinité de cette oxidase envers l’O2, plusieurs ordres de grandeur plus élevée que les affinités connues pour les protéines multicuivre plus largement utilisées dans les biopiles comme enzymes de réduction de O2. De façon originale, nous avons établi les fonctions chimiques requises pour obtenir une connexion directe de l’enzyme sur nanomatériaux carbonés. Grâce à cette fonctionnalisation de l’électrode, nous avons pu montrer que la CcO de A. ferrooxidans réduisait O2 à des potentiels 500 mV plus anodiques que les CcO neutrophiles. Cette affinité pour l’O2 et ce haut potentiel redox font de cette CcO une enzyme de choix pour développer une nouvelle génération de biopiles à combustible.

Micro-organisms are found in various ecosystems, where they have this ability to adapt to challenging conditions. Acidithiobacillus ferrooxidans, a gram negative bacterium, is one of the most studied and relevant model to understand how to survive in harmful environments such as pHs as low as pH 2 . A. ferrooxidans remarkable ability to gain energy through oxidation of ferrous iron at low pHs has also driven a lot of interest because of application in microbial leaching. Several metalloproteins have been identified and characterized from a biochemical point of view, including two diheme cytochromes and one cupredoxin. However, the whole electron transfer pathway from the outer membrane to the inner membrane cytochrome c oxidase (CcO) is still obscure. During this thesis, we reconstituted at the electrochemical interface one part of the respiratory chain of A. ferrooxidans with the aim to determine the electron transfer pathway step by step. We focused our attention on three interacting proteins: the CcO, a newly identified cupredoxin, AcoP, which is anchored in the membrane and copurifies with the CcO, and a diheme cytochrome (Cyt c4) supposed to interact with CcO. The strategy was to studied purified AcoP, Cyt c4 and CcO alone or incubated together in solution, or immobilized at an electrode mimicking one of the partner. Beyond thermodynamic data for each protein, this methodology offers the opportunity to decipher the molecular basis of protein-protein interaction favorable to electron transfer. We established and quantified the occurrence of an intermolecular electron transfer between Cyt c4 and AcoP, as well as between Cyt c4 and CcO and their consequence on the whole electron transfer pathway. With the objective of using this CcO at the cathode of biofuel cells to overcome some limitation, we studied the enzymatic properties of CcO towards the reduction of O2. We emphasized the outstanding properties of the CcO extracted from this acidophile, exemplified by a much higher affinity for O2 compared to classically used multicopper proteins such as bilirubin oxidases.We succeeded in the direct wiring of the CcO in carbon nanomaterials with suitable chemical functions, allowing to demonstrate its much higher redox potential than the other identified CcO so far. These two properties make this CcO from A. ferrooxidans an attractive reductase for use in a new generation of enzymatic fuel cells.