Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Maladies Infectieuses

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

virus géants,cytométrie en flux,bio-informatique,métagénomique,co-culture,

Keywords

giant viruses,cytometry,bio-informatic,metagenomic,co-culture,

Titre de thèse

Étude des grands virus à ADN nucléo-cytoplasmique: isolement et caractérisation.
Study of nucleo-cytoplasmic large DNA viruses: isolation and characterization.

Date

Vendredi 23 Novembre 2018

Adresse

IHU Méditerranée infection 19-21 Bd jean Moulin 13005 Marseille Amphithéâtre IHU

Jury

Directeur de these M. Bernard LA SCOLA IHU-méditerrannée infection
Rapporteur M. Bruno POZZETTO CHU Saint-Etienne
Examinateur Mme Florence FENOLLAR IHU-méditerrannée infection
Rapporteur M. Gilbert GREUB centre hospitalier universitaire vaudois
Examinateur Mme Gwenael PIGANEAU Observatoire océanique de Banyuls
Examinateur M. Pierre PONTAROTTI IHU méditerranée infection

Résumé de la thèse

La plupart des virus sont connus pour leur capacité à causer des maladies symptomatiques chez l’Homme et chez les autres animaux. Certains d’entre eux sont des grands virus à ADN nommés Virus à Grand ADN Nucléo-Cytoplasmique (NCLDV), rapportés comme infectant les cellules eucaryotiques. Au début du XXIème siècle, quatre familles ont été définies par Iyer et al. comme ayant une origine commune (groupe monophylétique): Asfarviridae, Phycodnaviridae, Irido-Ascoviridae et Poxviridae. En 2003, la description d’Acanthamoeba polyphaga mimivirus a cassé un paradigme dans le monde des virus. Par leur taille de particule (450nm), par leur longueur de génomes (supérieure à 1Mb) et leur contenu génique, leur découverte a changé la définition traditionnelle des virus (Lwoff). Depuis 2013 et notamment par les isolements successifs de Pandoravirus, Pithovirus et Mollivirus, ces virus ont été décrits comme possédant de nouvelles propriétés. Leur découverte a été rendue possible grâce à la méthode de co-culture utilisant des protistes, notamment des cellules du genre Acanthamoeba. Cette méthode a été de nombreuses fois modulée par différentes équipes. Dans notre cas, nous avons combiné différentes stratégies appliquées à notre co-culture : la co-culture a été couplée à la cytométrie en flux pour détecter la lyse des protistes. De plus, la cytométrie a été utilisée avec un marqueur à ADN dans le but d’identifier de façon putative le virus et de discriminer les différentes populations virales. Enfin, nous sommes capables de séparer ces populations en utilisant un appareil FACS trieur. L’ensemble de ces techniques a permis l’isolement de nouveaux virus. Ces isolats ont été caractérisés par séquençage et comparaison génomiques et l’étude de leur cycle réplicatif chez leurs hôtes a été effectuée. Nous avons décrit des nouvelles souches, espèces, lignées et familles putatives : des Faustovirus, Pacmanvirus, Pithovirus, des Pandoravirus, Cedratvirus, Orpheovirus et Fadolivirus. En parallèle, les études métagénomiques offrent l’opportunité de détecter des virus supplémentaires dans de grands ensembles de données. Ces virus sont « cachés » dans les bases de données publiques et sont souvent confondus ou mal-annotés (annotés comme des bactéries) par des outils automatiques. Ainsi, nous avons pu détecter et identifier trois génomes partiels de nouveaux virus dans des métagénomes variés. Dans le même temps, nous avons pu faire le séquençage génomique de deux infections humaines par des Poxviridae, caractérisées par une voie inhabituelle d’infection pour le Cowpox virus et suggérant l’implication du génotype pour l’infection à Orf virus. Finalement, ces descriptions révèlent une incroyable diversité génétique chez les grands virus et de nouvelles fonctions extraordinaires pour des virus. Nous pouvons noter que la plupart des protéines prédites restent totalement inconnues (ex. ORFans). Les différentes fonctions de ces protéines nécessitent des investigations pour explorer leur rôle dans le mode de vie viral. De plus, ces études surlignent la longue évolution de ces virus à coté du domaine de la vie des eucaryotes. Certains chercheurs considèrent que l’existence du 4ème domaine de la vie est faux et que le débat a été clos. Malgré cela, les virus aujourd’hui peuvent être plus grands que des bactéries intracellulaires et posséder tous les composants assurant la traduction protéique (tRNA, amino-acyles synthétases…). Certains de leurs gènes sont impliqués dans la réplication et la réparation du génome, certains dans le métabolisme des sucres et vitamines et d’autres participent à un système de défense contre les infections aux virophages. Les sous-unités ribosomales restent l’élément majeur manquant de ces virus. Seules les futures descriptions virales pourront élargir notre connaissance et compréhension des NCLDV. Grâce à tous ces éléments, nous pourrons définir les contours des familles, sous-familles et des genres composant l’ordre proposé des Megavirales.

Thesis resume

Most viruses are known for their ability to cause symptomatic diseases in humans and other animals. Some of them are large DNA viruses named Nucleo-cytoplasmic Large DNA viruses (NCLDV), known for infecting eukaryotic cells. At the beginning of the 21st century four families were defined by Iyer et al. as having a common origin (monophyletic group): Asfarviridae, Phycodnaviridae, Irido-Ascoviridae and Poxviridae. In 2003, the description of Acanthamoeba polyphaga Mimivirus broke this paradigm in the virus world. Because of their particles size (450 nm), their genome size (up to 1Mb), and their gene contents, their discovery changed the traditional definition of viruses (Lwoff). Since 2013 and the successive isolations of Pandoravirus, Pithovirus and Mollivirus; these viruses have been characterized as possessing various novel properties. Their discoveries have been possible thanks to the co-culture method using protist notably Acanthamoeba genus cells. This method went through multiple improvements and is employed by different teams in different ways. In our case and in order to enhance this method we combined strategies applied in our co-culture. Indeed, this method consists in using flow cytometry to detect lysis of protist cells (after all steps of co-culture enrichment). In addition, the flow cytometry was used with a DNA marker in order to identity viruses and discriminate viral populations. Then, we were able, using a FACS sorter device, to separate different viral populations from our supernatants. Altogether these techniques have permitted the isolation of new viruses. These isolates have been characterized by genome sequencing, genomic comparison and the study of the replicative cycles in their host. We described novel strains, species, lineages and putative families: Faustoviruses, Pacmanvirus, Pithovirus, Pandoraviruses, Cedratviruses, Orpheovirus and Fadolivirus. In parallel, metagenomic studies offer the opportunity to detect additional viruses in large datasets. These viruses are “hiding” in public database because they are sometimes confused and misannotated with bacteria when using automatic pipeline. For instance, we detected and identified three partial genome of novel viruses in various metagenomes. In the meantime, we also performed the genome sequencing of two human infections by Poxviridae characterized by unusual route of infection for the Cowpox virus and suggested the implication of genotype for the Orf virus infection. Finally, these descriptions revealed an unbelievable genetic diversity in large viruses and novel extra-ordinary functions for viruses. We realised that most of predicted proteins remain completely unknown (e.g ORFans). The different functions of these proteins need further investigations to explore their roles in the viral lifestyle. Moreover, these studies highlight the long evolution of these viruses close to the eukaryotic domain of life. Some researchers considered that the existence of a fourth domain of life is false and that this debate was closed. Despite this, today’s viruses can be larger than intracellular bacteria, possess all component of genes related in the translation (tRNAs, aminocacyl-tRNA synthetases,…). Some genes are implied in the genome replication and repair, some in the sugar metabolism, vitamin metabolism, and some others are implied in defences against virophage infections… The major missing element that we would need to successfully link them to the tree of life remains the absence of ribosomal subunits. Only future viral descriptions could enlarge our knowledge and understanding of Nucleo-cytoplasmic large DNA viruses. Thanks to all these elements we are hoping to define outlines of families, sub-families and future gena composing the proposed Megavirales order.