Soutenance de thèse de Hadrien ROBERT

Les expériences basées sur l’étude de phénomènes thermiques à l’échelle microscopique peuvent s’avérer compliquées à mettre en place, principalement à cause de l'absence de microscopies thermique non-invasives et fiables. Dans la plupart des cas, ces expériences consistent à chauffer l’échantillon entier, voire l’ensemble du microscope. Mais un tel chauffage implique une grande inertie thermique et peut entrainer une dérive des pièces mécaniques et une dilatation des composants optiques du microscope. Pour répondre à ces problèmes, j’ai monté un microscope capable de contrôler la température de l’échantillon à une échelle microscopique et d'acquérir des images de température, de phase et de fluorescence. Toutes les expériences ont été basées sur le chauffage de nanoparticules d’or déposées sur une lamelle de microscope et illuminées à leur résonance plasmonique, ce qui entraine une dissipation de la chaleur exaltée. Du fait de l’augmentation de température, le milieu environnant les nanoparticules subit un changement local de l’indice de réfraction qui peut être directement mesuré avec un analyseur de front d’onde. Basée sur la mesure de la distorsion de front d’onde, une technique de mesure de température appelée Imagerie Thermique utilisant l’Interférométrie à Décalage Quadri-latéral (TIQSI) a été développée. A l’aide de cette technique et des différentes modalités d’imagerie du microscope, j’ai pu aborder trois problèmes différents : une nouvelle technique de synthèse chimique hydrothermale, l’étude d’organismes hyperthermophiles et la réponse à un stress de chaleur de cellules eucaryotes. La synthèse hydrothermale regroupe les réactions chimiques basées sur l’utilisation d’eau liquide à des températures bien plus élevées que la température d’ébullition (typiquement entre 100◦C et 250◦C). Pour que l’eau reste à l’état liquide à de telles températures, on utilise en générale des compartiments pressurisés appelés autoclaves. Des expériences récentes ont montré que l’on pouvait obtenir de l’eau surchauffée à pression ambiante par chauffage de nanoparticules d'or. J’ai pu ainsi, à l’aide du microscope, générer des réactions chimiques hydrothermales à pression ambiante en synthétisant des microcristaux, un nouveau concept en chimie de synthèse. Une autre application concernant le surchauffage de l'eau liquide a été abordée en biologie. Les hyperthermophiles sont des cellules vivant à de très hautes températures (jusqu’à 110°C pour certains). L’étude de ces organismes a permis d’importantes avancées scientifiques comme le développement de la fameuse technique de Réaction en Chaîne par Polymérase (PCR) ou l’incorporation de nouvelles espèces dans l’arbre phylogénétique du vivant. A cause de leur condition de vie extrême, les hyperthermophiles sont souvent cultivés dans des autoclaves. Grâce au microscope que j'ai développé, j’ai pu observer pour la première fois des archées hyperthermophiles vivantes, et notamment leur déplacement. Cette avancée devrait permettre la mise en place d’expériences plus ambitieuses comme l’étude de l’interaction entre des archées et des bactéries. Une cellule eucaryote peut être endommagée par une hausse de température (souvent entre 37 et 42°C) ce qui peut entrainer des mutations et la rendre non fonctionnelle. Les cellules eucaryotes ont un mécanisme de défense appelé Réponse à un Stress Cellulaire (HSR) permettant de les protéger de ce stress. Ce mécanisme se traduit par la synthèse de protéines appelées HSP (Heat Stress Proteins) qui ont pour fonction de réparer les polypeptides et les protéines endommagés par la chaleur. La synthèse des HSP est liée à l’activité de facteurs de transcription appelés HSF (Heat Shock Factor). En marquant des HSF1 avec un fluorophore, j’ai pu observer la réponse de cellules à un stress thermique avec une dynamique de l'ordre de la seconde.

Nowadays, thermal experiments at the microscopic scale remain challenging to conduct due to the lack of reliable and non-invasive temperature microscopies. Usually, to study the temperature dependence of a sample under an optical microscope, scientists have to heat the whole sample, or even the whole microscope. This approach features some limitations, such as a large thermal inertia, a mechanical drift due to thermal dilatation, etc. To solve these problems, I built a microscope aimed to control heat diffusion on the microscale and acquire temperature, optical phase and fluorescence images in parallel. Heat was generated using a layer of gold nanoparticles that undergo an enhancement heat generation upon illumination at their plasmonic resonance. This approach leads to a weak thermal inertia and allows an easy control of the heating area. Generated heat induces local change of the nanoparticles refractive index surrounding medium which can be measured with an optical wavefront sensor. From the wavefront distorsion, a non-invasive technique called Thermal Imaging using Quadriwave Shearing Interferometry (TIQSI) has been developped to measure temperature at the microscale. Using this approach, I addressed three kinds different problems : a new synthesis method in hydrothermal chemistry, the study of hyperthermophile microorganisms and the response of eukaryotic cells to an heat shock. Hydrothermal methods in chemical synthesis rely on the use of superheated liquid water as a solvent, i.e., liquid water heated above its boiling point, typically from 100°C to around 250°C. To prevent water from boiling and keep its liquid state at such high temperatures, the usual process involves the use of a pressure chamber, named autoclave. It has been shown that gold nanoparticles can be used as nanosources of heat to increase a liquid temperature far above its boiling point, even at ambient pressure. By generating superheating liquids, I managed to conduct hydrothermal chemistry experiments at ambient pressure, as evidenced by the synthesis of microcrystals, which represents a new paradigm in chemistry. Still as an application of the possibility to superheat a fluid with gold nanoparticles, I studied hyperthermophile organisms. Hyperthermophile cells need high temperature to live (from 80 to 110°C ). Their study is an active research field, which led to relevant discoveries such as the Polymerase Chain Reaction (PCR) or important steps forward on the construction of the phylogenetic tree. Studying hyperthermophiles remains complicated, the use of an autoclave is indeed required. The microscope I built allowed one of the first observations of hyperthermophiles alive, at ambient pressure (no autoclave) and pave the way to more sophisticated experiments such as the study of the interaction between archaea and bacteria organisms. A last part of my thesis has been dedicated to the study of single mammalian cells in cultures. When exposed to a heat stress (typically between 37 to 42°C), eukaryote cells possess a defense mechanism called Heat Stress Response (HSR) that relies on the synthesis of proteins called HSP (Heat Stress Proteins). The HSP role is to repair damaged polypeptides and proteins. HSP synthesis is controlled by the activation of transcription factors called HSF (Heat Shock Factor). HSF1 were labelled with GFP fluorophores, which allowed the observation of their local heat shock response at short time scales (on the second time scale), using the microscope I developed. This development is aimed to favor developments in a new field of research named single cell thermal biology.