Soutenance de thèse de Yasmina AUGUSTE

L’infertilité est définie par l’OMS comme l’incapacité à concevoir un enfant dans un couple, après au moins douze mois de rapports sexuels réguliers sans protection. Elle concerne 15 % des couples qui désirent avoir un enfant, un facteur masculin est retrouvé dans 50 % des cas. Dans le cadre de cette thèse, les principaux objectifs étaient de déterminer des causes génétiques d’infertilité masculine chez des patients atteints d'oligozoospermie sévère (OS) ou d'asthénozoospermie en lien avec des anomalies morphologiques des flagelles, afin de mieux comprendre la spermatogénèse, d’améliorer la prise en charge des couple infertiles et d'évaluer les risques de transmission à leur descendance. Nous avons abordé ces problématiques par le séquençage d’exome entier d'hommes ayant un de ces phénotypes au sein de deux familles consanguines. La première famille consanguine comprend cinq frères ayant une OS. Nous avons identifié p.Glu101* dans le gène EXD1 comme le seul variant perte-de-fonction homozygote chez les cinq frères affectés. Nous avons identifié trois autres individus avec une azoospermie, hétérozygote pour un variant rare dans EXD1 (p.Asp434Metfs*2, p.Ala547Gly ou p.Arg372His). EXD1 (Exonuclease domain-containing 1) est une protéine qui se fixe aux ARN mais n’a pas d’activité exonucléase. Par une interaction avec TDRD12, EXD1 fait partie du complexe PET (PIWI-EXD1-TDRD12) qui intervient dans la biogénèse des piARN (PIWI-interacting RNA) et l’inhibition de la rétrotransposition. Chez la souris, EXD1 promeut la localisation nucléaire de la protéine PIWI, MIWI2. EXD1 est le premier gène identifié comme muté dans un cas d’OS chez l’homme. Nous avons montré que la protéine EXD1 est spécifique aux testicules et localisée au niveau du cytoplasme des spermatocytes. L’étude in vitro des variants hétérozygotes nous a permis de définir trois domaines fonctionnels de la protéine, inconnus jusqu'alors. En effet, nous avons identifié un NES (signal d’export nucléaire), une région nécessaire à la localisation nucléaire et une zone de dimérisation. Ces résultats nous ont permis de proposer un modèle pour le rôle d’EXD1 au sein du complexe PET. EXD1 assurerait le transport du complexe PET entre le noyau et le cytoplasme. Le complexe PET avec MIWI2 serait transloqué dans le noyau des spermatogonies et des spermatocytes, où MIWI2 chargé avec un piARN ciblerait et réprimerait la transcription des retrotransposons en induisant des modifications de la chromatine. Ensuite EXD1 permettrait l’export d'au moins TDRD12 vers le cytoplasme pour l'import d'un nouveau complexe PET. Dans deux cas d'asthenozoospermie caractérisés par un fort incidence de flagelles courts ou absents, nous avons identifié trois allèles perte-de-fonction rares bialleliques dans le gène WDR66: p.Asp42Metfs*2, homozygote chez deux frères, et p.Glu111*; p.Leu530Cysfs*8, hétérozygote composite chez un homme non apparenté. WDR66 code la protéine CFAP251, l'orthologue de FAP251, une protéine de l'axonème nécessaire au battement du flagelle chez Chlamydomonas. Par analyse Western blot, nous avons montré que la protéine CFAP251 est absente des spermatozoïdes des patients et, par microscopie électronique, que cela perturbe la formation de la gaine mitochondriale. L'ensemble des résultats de cette thèse apportent des éléments de réponses sur de nouvelles causes génétiques d’infertilité masculine liée à une anomalie quantitative ou qualitative de la spermatogénèse. De plus, nos résultats concernant EXD1 nous interrogent sur la possibilité de transmission de mutations génétiques ou modifications de marques épigénétiques à la descendance en Assistance Médicale à la Procréation pour certains patients avec une oligozoospermie.

Infertility is defined by the WHO as the inability of a couple to conceive a child after twelve months of unprotected regular sexual intercourse. It concerns 15% of couples who wish to have a child, and a male factor is found in 50% of cases. In this thesis, the main objectives were to determine genetic causes of male infertility in patients with severe oligozoospermia (SO) or asthenozoospermia related to morphological abnormalities of the flagella, in order to better understand spermatogenesis, improve the care of infertile couples and inform risk evaluation for their offspring. We addressed these objectives by sequencing the whole exome of men with one of these phenotypes within two consanguineous families. The first consanguineous family includes five brothers with SO. We identified p.Glu101 * in the EXD1 gene as the only loss-of-function variant homozygous in the five affected siblings. We identified three other azoospermic men as heterozygous for a rare variant in EXD1 (p.Asp434Metfs * 2, p.Ala547Gly or p.Arg372His). EXD1 (Exonuclease domain-containing 1) is a protein that binds to RNAs but has no exonuclease activity. By an interaction with TDRD12, EXD1 is part of the PET complex (PIWI-EXD1-TDRD12) that is involved in the biogenesis of piRNAs (PIWI-interacting RNA) and the inhibition of retrotransposition. In the mouse, EXD1 promotes the nuclear localization of the PIWI protein, MIWI2. EXD1 is the first gene identified as mutated in a case of SO in humans. We have shown that the EXD1 protein is testis-specific and localized to the cytoplasm of spermatocytes. Our in vitro study of heterozygous variants allowed us to define three previously unknown functional domains of the protein. We have identified a NES (nuclear export signal), a region necessary for nuclear localization and a dimerization zone. Based on these results we have proposed a model for the role of EXD1 within the PET complex. EXD1 would transport the PET complex between the nucleus and the cytoplasm. The PET complex with MIWI2 would be translocated into the spermatogonia and spermatocyte nucleus, where MIWI2 loaded with a piRNA would target and repress the transcription of retrotransposons by inducing chromatin remodeling. Then EXD1 would export at least TDRD12 to the cytoplasm for the import of a new PET complex. In two cases of asthenozoospermia characterized by a high incidence of short or absent flagella, we identified three rare biallelic loss-of-function alleles in the WDR66 gene: p.Asp42Metfs*2, homozygous in two brothers, and p.Glu111*; p.Leu530Cysfs*8, compound heterozygous in an unrelated man. WDR66 encodes the protein CFAP251, the ortholog of FAP251, an axonemal protein required for efficient flagellar beating in Chlamydomonas. By Western blot analysis, we have shown that CFAP251 protein is absent from patients' spermatozoa and, by electron microscopy, that this disrupts the formation of the mitochondrial sheath. The results presented in this thesis reveal new genetic causes of male infertility related to a quantitative or a qualitative abnormality of spermatogenesis. Moreover our findings concerning EXD1 raise questions about the risk that, for some patients with oligozoospermia, medically assisted reproduction could transmit de novo genetic or epigenetic modifications to future generations.