Soutenance de thèse de Adam BARRADA

Target of rapamycine est une large Ser/Thr Kinase appartenant à la famille des phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases (PIKKs). Cette protéine est la composante centrale de la voie de signalisation de TOR, régulant la croissance cellulaire et le métabolisme en réponse à des facteurs environnementaux chez les eucaryotes. TOR a été le sujet de nombreuses études chez les animaux à cause de son implication dans des maladies. Cependant, chez les plantes l’exploration de cette voie est moins avancée à cause d’un manque de système d’inhibition efficace de TOR et d’outils biochimiques. Le développement récent d’inhibiteurs du site actif de TOR (asTORis) pour des applications médicales a ouvert de nouvelles possibilités pour les chercheurs étudiant la voie de TOR. En effet, il a été montré que les asTORis réduisaient la croissance de la racine primaire de manière TOR gène-dose dépendante. La haute spécificité de certaines de ces molécules envers TOR combinée avec un phénotype facilement détectable nous ont permis de réaliser des cribles génétiques de mutants éthyle methanesuflfonate (EMS) pour des plantes mutées dans la voie de TOR. Dans un premier crible de mutants résistants à l’inhibiteur ATP-competitif de TOR AZD-8055, nous avons trouvé que des mutants perte de fonction de la DYRK (Dual Specificty Tyrosine Phosphorylation regulated kinase) kinase YAK1 sont résistants à l’AZD-8055 et, réciproquement, que des surexpresseurs sont hypersensibles. Ces phénotypes étaient conditionnels à l’inhibition de TOR, positionnant l’activité de YAK1 en avale de TOR. L’analyse de microscopie a révélé que YAK1 fonctionne comme un répresseur de taille du méristème et induit la différentiation en réponse à l’inhibition de TOR. Nous avons utilisé pINDY, l’inhibiteur ATP-competitif de DYRK1A pour montrer que YAK1 réprimait l’expression de cyclines dans les différentes zones du méristème racinaire. Finalement, nous démontrons que YAK1 est essentiel pour la régulation transcriptionnelle TOR-dépendante des gènes SIAMESE-RELATED (SMR) qui sont des inhibiteurs de cycline-dépendante kinases spécifiques de plantes dans des cellules méristématiques et en différentiation de la racine. Donc, YAK1 est un régulateur de l’activité méristématique et de la différentiation en avale de TOR. Dans ce même crible nous avons trouvé une mutation dominante, dans le domaine catalytique de TOR causant une résistance à des inhibiteurs ATP-compétitifs. Cette résistance pourrait être causée par une augmentation de l’activité ou une baisse de l’affinité pour l’AZD-8055. Dans un second crible nous avons isolé des mutants résistants et hypersensibles à un dose plus faible d’AZD-8055. En plus de mutants dans d’autres membres potentiels de la voie de TOR, nous avons trouvé de nouveaux allèles de TOR causant une hypersensibilité à l’AZD-8055. Des expériences de modélisation 3D, du domaine kinase ainsi que de docking suggèrent que l’une des mutations augmenterait l’affinité pour l’inhibiteur. Ces nouveaux allèles offrent des outils intéressants pour l’étude de la fonction de TOR de plantes.

Target of Rapamycin (TOR) is a large and highly conserved Ser/Thr kinase belonging to the family of phosphatidylinositol 3-kinase-related kinases (PIKKs). This protein is the central component of the TOR signaling pathway, which regulates cell growth and metabolism in response to environmental cues in eukaryotes. TOR has been the subject of many studies in animals due to its implication in diseases. However, in plants the exploration of this pathway is less advanced due to a lack of efficient TOR inhibition systems and biochemical tools. The recent development of active site TOR inhibitors (asTORis) for medical applications has created a new opportunity for plant researchers studying TOR. Indeed, it was shown that asTORis reduce primary root growth in a TOR gene-dose dependent manner. The high specificity of some of these molecules towards the TOR kinase combined with an easily detectable phenotype have permitted us to perform genetic screens for Arabidopsis thaliana ethyl methanesulfonate (EMS) mutants for plants mutated in the TOR pathway. In a first screen for mutants resistant to the ATP-competitive TOR inhibitor AZD-8055, we found that loss of function mutants of the DYRK (Dual Specificity Tyrosine Phosphorylation Regulated Kinase) kinase YAK1 are resistant to AZD-8055 and, reciprocally, that YAK1 overexpressors are hypersensitive. Significantly, these phenotypes were conditional on TOR inhibition, positioning YAK1 activity downstream of TOR. Microscopy analysis revealed that YAK1 functions to repress meristem size and induce differentiation in response to TOR inhibition. We further used the ATP-competitive DYRK1A inhibitor pINDY to show that YAK1 represses cyclin expression in the different zones of the root meristem. Finally, we demonstrate that YAK1 is essential for TOR-dependent transcriptional regulation of the plant specific SIAMESE-RELATED (SMR) cyclin-dependent kinase inhibitors in both meristematic and differentiating root cells. Thus, YAK1 is a major regulator of meristem activity and cell differentiation downstream of TOR. In the same screen we found a dominant mutation, in the TOR catalytic domain which causes resistance to an ATP-competitive TOR inhibitor. This resistance could be caused by an increase in TOR activity or a decreased affinity for AZD-8055. In a second screen we isolated mutants that were resistant or hypersensitive to a lower AZD-8055 dose. Besides mutants in other potential members of the TOR pathway, we found new TOR alleles that cause hypersensitivity to AZD-8055. 3D modeling of the TOR kinase domain and docking assays suggest that one of these mutations increases affinity for the inhibitor. These new TOR alleles offer interesting tools for the study of TOR function in plants. Indeed, alteration of TOR activity through point-mutations could cause a modified tolerance to certain environmental stresses.