Soutenance de thèse de Seddik HARCHOUNI

Les triacylglycérol (TAG) est un métabolite hautement énergétique qui peut être facilement converti en biodiesel. Les TAG peuvent être produits à partir de plantes et de microalgues. Cependant, les plantes ont de faibles rendements en TAG dans leurs tissus végétatifs et les microalgues peuvent accumuler de grandes quantités de TAG, mais uniquement dans des conditions de stress, ce qui inhibe la croissance et limite les rendements. L'étude et la manipulation des voies de signalisation du stress et de l'énergie peuvent offrir de nouvelles stratégies pour améliorer l'accumulation de biomasse et de TAG sans compromettre la croissance. Dans cette thèse, j'ai étudié le rôle de deux voies principales de signalisation énergétique : la voie du de guanosine ppGpp (guanosine penta(tétra) phosphate) dans le chloroplaste et la voie de TOR (Target of rapamycin) dans le cytosol . J'ai choisi de travailler sur la mousse Physcomitrella patens, un modèle intéressant d'eucaryote photosynthétique en raison de sa position évolutive entre les algues et les plantes vasculaires. Pour étudier le rôle du ppGpp chez la mousse P. patens, nous avons créé des lignées transgéniques exprimant de manière inductible une ppGpp synthase (SYN) et sur-accumulant le ppGpp. J'ai examiné les effets de l'accumulation de ppGpp sur la physiologie de la mousse par microscopie et biochimie. J'ai trouvé que l'induction de SYN provoque une forte inhibition de la capacité photosynthétique en raison de l'inhibition de l'expression des protéines clés codées par les chloroplastes. Ceci était associé à la réorganisation du système membranaire thylakoïdien en super grana. J'ai également étudié l'effet de ppGpp sur différents tissus de mousse et son effet sur l'acclimatation de la mousse à différents stress. Pour étudier le rôle de TOR dans le métabolisme lipidique de la mousse, j'ai d'abord développé une nouvelle méthode permettant de visualiser facilement l'accumulation de TAG avec un nouveau marqueur lipidique appelé AC-202. J’ai testé ce marqueur in vivo chez l'algue verte C. reinhardtii et la diatomée Phaeodactylum tricornutum. J'ai trouvé que l'AC-202 se colocalise avec le marqueur lipidique BODIPY et donne un signal fluorescent plus élevé. Contrairement aux colorants lipidiques rouges tels que le NILERED, la fluorescence d’AC-202 n’interfère pas avec l’autofluorescence de la chlorophylle. De plus, j'ai montré que l'AC-202 pouvait être utilisé avec d'autres reporters émettant dans le vert et le rouge. Ensemble, ces caractéristiques font de l’AC-202 un outil très utile pour visualiser l’accumulation de TAG dans les plantes et les algues. J'ai finalement étudié le rôle de TOR dans le métabolisme des lipides chez la mousse. J'ai montré que le traitement du protonema de P. patens avec des inhibiteurs de TOR du site actif de TOR provoque une inhibition de la croissance de manière dose dépendante et s'accompagne d’une accumulation de TAG. Fait intéressant, en utilisant l'AC-202, j'ai observé que l'inhibition de TOR entraînait la perte de petites vésicules associées à la croissance, marquées par l'AC-202 et l'accumulation de plus grandes structures de corps lipidiques. D'autres études sur la manière dont les voies de signalisation de l’énergie contrôlent le métabolisme des lipides permettront de développer de nouvelles stratégies pour améliorer la production de biocarburants chez les organismes photosynthétiques.

Triacylglycerol (TAG) is a highly energetic metabolite that can be easily converted into biodiesel. TAG can be produced from both plants and microalgae. However, plants have low TAG yields in their dominant vegetative tissues. Microalgae can accumulate high amounts of TAG, but only under stress, leading to growth inhibition and limiting yield. The study and manipulation of stress and energy signaling pathways can offer new strategies to improve biomass and TAG accumulation without compromising growth. In this thesis, I studied the role of two major energy signaling pathways: the guanosine penta(tetra) phosphate (ppGpp) pathway in the chloroplast and the target of rapamycin (TOR) pathway in the cytosol. I chose to work on the moss Physcomitrella patens, which is an interesting model of photosynthetic eukaryote because of its evolutionary position between algae and vascular plants. To study the role of ppGpp in the moss P. patens we created transgenic lines that inducibly express a ppGpp synthase (SYN) and over-accumulate ppGpp. I examined the effects of ppGpp accumulation on moss physiology by microscopy and biochemistry. I found that the induction of SYN causes a strong inhibition of photosynthetic capacity due to the inhibition of the expression of key chloroplast encoded proteins. This was associated with the reorganization of the thylakoid membrane system into super grana. I also investigated the effect of ppGpp on different moss tissues, and its effect on the acclimation of moss to different stresses. To study the role of TOR in moss lipid metabolism I first developed a new method to easily visualize TAG accumulation with a new lipid dye called AC-202 in the green algae C. reinhardtii and the diatom Phaeodactylum tricornutum. I found that AC-202 colocalizes with the lipid dye BODIPY, and gives a higher fluorescent signal. Unlike red lipid dyes such as Nile Red, AC-202 fluorescence does not interfere with chlorophyll autofluorescence. Moreover, I showed that AC-202 can be used with other reporters emitting in the green and red. Together these features make AC-202 a very useful tool for visualizing TAG accumulation in plants and algae. I finally studied the role of TOR in moss lipid metabolism. I showed that treatment of P. patens protonema with active site TOR inhibitors causes growth inhibition in a dose dependent manner and is accompanied by TAG accumulation. Interestingly, by using AC-202 I observed that TOR inhibition leads to the loss of small growth associated vesicles marked by AC-202 and the accumulation of larger oil body structures. Further studies on how these energy signaling pathways control lipid metabolism will allow the development of new strategies for improving biofuel production in photosynthetic organisms.