Soutenance de thèse de Diane RATTIER

La gastrulation est une étape essentielle de l’embryogénèse étant donné qu’elle déploie les principaux plans corporels en induisant la formation de la séquence primitive (PS) ; et prépare l’embryon pour l'organogenèse en induisant la formation des trois couches germinales, l’Ectoderme (EC), l’Endoderme Définitif (DE) et le Mésoderme (ME). Ce processus nécessite un contrôle coordonné de multiples activités cellulaires telles que le réarrangement des cellules épithéliales, la migration, et la différenciation cellulaire. Des années de recherche ont mis en évidence que chez les mammifères, la gastrulation est sous le contrôle d'une cascade de signalisation impliquant les morphogènes Bmp, Wnt et Activin. Néanmoins, l’étude in vivo des mécanismes précis contrôlant la mise en place de la signalisation dans l’espace, et du sort des cellules qui en découle, demeure encore ardu. Grâce à leurs capacités à s'auto-renouveler et à se différencier dans les trois couches germinales, les cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) constituent un excellent système in vitro pour étudier les mécanismes régulant la signalisation et la différenciation, ainsi que pour modéliser la gastrulation des mammifères. Plusieurs études récentes basées sur les hPSCs ont révélé que l'organisation et la structure des tissus, qui émerge des interactions des cellules entre elles et avec la matrice extracellulaire ; affecte l’établissement de la signalisation en régulant l'accessibilité des récepteurs aux morphogènes environnants. Durant ma thèse, j'ai exploré comment la perturbation de l’intégrité épithéliale des hPSCs affecte leurs capacités à percevoir les morphogènes et à se différencier en PS. Pour ce faire, j'ai utilisé des hPSCs mutantes pour le GLYPICAN-4 (GPC4); un protéoglycane heparan-sulfate membranaire qui module la signalisation Bmp, Wnt, Fgf et Shh. De façon intéressante, les cultures dérivées d’hPSCs GPC4-mutantes présentent une perte d'intégrité épithéliale locale, caractérisée par la présence de zones dispersées au sein desquelles les cellules possèdent une surface apicale réduite avec des côtés latéraux exposés au milieu. En réalisant des analyses moléculaires et fonctionnelles, j'ai démontré que la perte d'intégrité épithéliale n'affecte pas l'identité des hPSCs, leurs propriétés d'auto-renouvellement et leur survie. En revanche, la perturbation de l'intégrité épithéliale des hPSCs améliore considérablement leur capacité à se différencier en PS, DE et ME après stimulation par des morphogènes. Notamment, seules les cellules localisées au sein des zones dans lesquelles l’intégrité épithéliale est perdue se différencient en PS, suggérant qu’elles sont plus sensibles aux morphogènes environnants. Pour étayer cette possibilité, j’ai réalisé des tests de stimulation avec les morphogènes BMP4, WNT3A et ACTIVIN A. Mes résultats mettent en évidence que la perturbation de l'intégrité épithéliale favorise l'activation des voies de signalisation BMP et ACTIVIN, mais pas celle de WNT. De plus, j’ai également constaté que la perturbation de l'intégrité épithéliale permet le maintien de la signalisation BMP et ACTIVIN dans le temps. Ensemble mes résultats illustrent la preuve de concept selon laquelle l'intégrité épithéliale façonne l’établissement de la signalisation dans l’espace et la différenciation qui en découle. Ils suggèrent également que l'émergence de la PS pourrait résulter d'une perturbation locale des jonctions épithéliales de l'embryon. Ainsi, ces travaux approfondissent notre compréhension des mécanismes régulant la signalisation et la différenciation au cours du développement humain.

Gastrulation is one of the most critical steps of embryonic development as it unfolds the primary body plans by inducing the formation of the Primitive Streak (PS) and primes the blastocyst for organogenesis by promoting generation of the three germ layers, Ectoderm (EC), Definitive Endoderm (DE) and Mesoderm (ME). This process requires a coordinated control of multiple cellular activities such as epithelial cell rearrangement, migration and cell differentiation. Years of research have revealed that mammalian gastrulation is under the control of a signaling cascade involving Bmp, Wnt and Activin morphogens. Yet, investigating the mechanisms by which morphogens signaling activity and cell fate are precisely patterned in the embryo remains challenging. Owing to their capabilities to self-renew and to differentiate into all the three germ layers, human pluripotent stem cells (hPSCs) have emerged as a powerful vitro system to study mechanisms underlying early fate acquisition and tissue patterning, as well as to model mammalian gastrulation. Recently, studies based on hPSC-derived technologies highlighted that tissue-level organization, emerging from cell-extracellular matrix and cell-cell interactions; act as a key regulator of signaling-dependent fate by regulating receptor accessibility to surrounding morphogens. In the light of these discoveries, during my thesis I explored whether signaling patterning and differentiation of hPSCs into PS could be regulated by a disruption of their epithelial integrity. To answer to this question, I took advantage of hPSCs down-regulated for the GLYPICAN-4 (GPC4); a membrane bound Heparan-sulfate proteoglycan that has been described as modulator of Bmp, Wnt, Fgf and Shh signaling. Interestingly, cultures derived from GPC4 down-regulated hPSCs display localized loss of the epithelial integrity; characterized by the presence of scattered areas in which cells have reduced apical surface with lateral sides exposed to the medium. By performing molecular and functional studies, I demonstrated that disruption of epithelial integrity does not affect hPSC identity, self-renewal properties, and survival. However, loss of epithelial integrity strongly enhances the capability of hPSCs to differentiate into PS and subsequently into DE and ME upon morphogen stimulation. Strikingly, only cells within areas of disrupted epithelial integrity differentiate into PS, suggesting that perturbing epithelial organization sensitize cells to respond to morphogens. In support of this possibility, stimulation assays with BMP4, WNT3A and ACTIVIN A ligands highlighted that loss of epithelial integrity allows activation of BMP and ACTIVIN pathways but not WNT. In addition to regulate perception, I found that disruption of epithelial integrity prolongs the activation of BMP and ACTIVIN signaling pathways. Overall, my results illustrate the proof of concept that epithelial integrity is a key regulator of spatial and temporal patterning of signaling and differentiation. They also suggest that in embryos, PS formation could arise from a local disruption of the epithelial junctions. Thus, our research deepens the comprehension of human development and unveils new inputs for understanding mechanisms regulating signaling patterning and differentiation.