Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Pathologie Vasculaire et Nutrition

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

intracellulaire,plaquettes,signalisation,cytométrie,

Keywords

cytometry,intracellular,pathway,platelets,

Titre de thèse

Apport de la cytométrie de flux intracellulaire à l’étude de la signalisation intra-plaquettaire
Contribution of intracellular flow cytometry to the study of intraplatelet signalling

Date

Mercredi 2 Décembre 2020 à 15:00

Adresse

27 Boulevard Jean Moulin, 13385 Marseille 1

Jury

Directeur de these Mme Marie-christine ALESSI CHU MARSEILLE
CoDirecteur de these M. Matthias CANAULT Centre de recherche en Cardiovasculaire et nutrition
M. Fabrice MALERGUE Immunotech Beckman Coulter
Rapporteur Mme Chloé JAMES CHU Bordeaux

Résumé de la thèse

Une fois dans la circulation les plaquettes se lient entre elles et à la paroi du vaisseau endommagé afin d'éviter une perte excessive de sang. Les désordres plaquettaires exposent à un risque de saignement ou de thrombose selon que leur capacité à s’activer est basse ou élevée. Les pathologies plaquettaires quantitatives (thrombopénie) sont facilement détectables par les automates à numération disponibles dans les laboratoires d’analyses médicales. Par contre le diagnostic différentiel entre une cause héréditaire (origine médullaire) ou immunologique (destruction périphérique) peut s’avérer difficile. Cette complexité est source d’errance diagnostique, de prise en charge inadaptée et de mauvaise évaluation du pronostic. Les défauts plaquettaires qualitatifs (thrombopathies) sont de diagnostic difficile. Contrairement aux thrombopénies il n'y a pas de test automatisé et simple pour les authentifier. Une grande partie de ces déficits reste méconnue et expose à un risque hémorragique en situation chirurgicale ou traumatique. Reconnaitre et caractériser les causes moléculaires des pathologies plaquettaires héréditaires et mettre au point des méthodes de diagnostic rapide sont de véritables challenges de santé. Notre travail a utilisé une technique simple et rapide développée par le laboratoire Beckman pour détecter les antigènes dans les globules rouges et les plaquettes à partir de sang total. Cette nouvelle méthode est robuste, avec une excellente précision intra- essai. Elle permet une bonne stabilité des cellules et du marquage jusqu'à 24 heures sans besoin de fixation. Nous avons montré la capacité de cette technique à détecter des protéines membranaires et solubles des granules α plaquettaires. Nous avons confirmé que la lignée cellulaire HEL pouvait être induite vers une différenciation mégacaryocytaire. Grâce au protocole mis en place nous avons mis en évidence à la fois les marqueurs de surface mais également la diminution de l’expression de la protéine MYH10 dans ces cellules au cours de leur différenciation.

Thesis resume

Once in the circulation, platelets bind to each other and to the damaged vessel wall to prevent excessive blood loss. Platelet disorders expose patients to a risk of bleeding or thrombosis depending on whether their ability to activate is low or high. Quantitative platelet pathologies (thrombocytopenia) are easily detected by the automatic counting machines available in medical analysis laboratories. On the other hand, differential diagnosis between a hereditary (central origin) or immunological (peripheral destruction) cause can be difficult. This complexity is a source of erroneous diagnosis, inappropriate management and poor prognosis assessment. Qualitative platelet defects (thrombopathies) are difficult to diagnose. Unlike thrombocytopenia, there is no simple automated test to authenticate them. A large part of these deficits remains unknown and exposes to a risk of bleeding in surgical or traumatic situations. Recognizing and characterizing the molecular causes of hereditary platelet pathologies and developing rapid diagnostic methods are real health challenges. Our work used a simple and rapid technique developed by the Beckman laboratory to detect antigens in red blood cells and platelets from whole blood. This new method is robust, with excellent intra-assay precision. It allows good cell stability and labeling for up to 24 hours without the need for fixation. We have demonstrated the ability of this technique to detect membrane and soluble proteins from α platelet granules. We confirmed that the HEL cell line could be induced towards megakaryocyte differentiation. Thanks to the established protocol we highlighted both the surface markers but also the decrease of MYH10 protein expression in these cells during their differentiation.