Soutenance de thèse de Samia NISAR

Le paludisme cause environ un million de décès par an, principalement en Afrique. La gravité de la maladie est influencée par de nombreux facteurs incluant les facteurs génétiques de l'hôte. Mon travail de thèse porte sur l'identification et la caractérisation fonctionnelle de variants génétiques impliquées dans la résistance/susceptibilité aux formes graves (FGs) de paludisme en combinant des études bioinformatiques et génétiques. Plusieurs études d’association sur l’ensemble du génome ont permis d’identifier des loci associés aux FGs. Néanmoins, seul un nombre limité de loci et de variants ont été répliqués dans des populations indépendantes. La première partie de mon projet a été d'évaluer systématiquement l'effet régulateur potentiel des SNPs en déséquilibre de liaison (DL) avec les tagSNPs associés aux FGs. En utilisant des outils bioinformatiques, nous avons priorisé ces variants et avons identifié que les 5 meilleurs candidats (rs11240734, rs1541252, rs1541253, rs1541254 et rs1541255) sont situés à proximité les uns des autres sur le chromosome 1 dans la région du gène ATP2B4. Nos résultats ont ainsi permis de prédire que ces variants auraient un effet régulateur, alors que les tagSNPs seraient peu fonctionnels. La protéine ATP2B4 est la principale pompe calcium des érythrocytes (les cellules hôtes du stade pathogène des parasites) et l'altération de son expression pourrait donc affecter la concentration en calcium intra-érythrocytaire et le développement des stades intra-érythrocytaires du parasite. Nous avons confirmé l’association du tagSNP (rs10900585) avec les FGs au Sénégal et la méta-analyse confirme cette association dans plusieurs populations. Nous avons montré que les 5 candidats (allèle majeur comme allèle à risque) sont également associés aux FGs au Sénégal. Pour les variants rs10751450, rs10751451 et rs10752452 précédemment décrits comme fonctionnels et altérant l'expression d'ATP2B4, nous avons obtenu une association avec les FGs dans notre population d’étude. Un fort DL a été observé entre ces 3 SNPs et les 5 SNPs candidats et l'analyse des haplotypes a révélé que les individus homozygotes pour l'haplotype composé des allèles majeurs présentaient un risque plus élevé de développer une FG. Dans la partie suivante, nous avons étudié l'effet fonctionnel de ces variants sur la régulation du gène ATP2B4 en utilisant différentes approches fonctionnelles. Les expériences de gène rapporteur ont permis de montrer une activité promoteur et amplificateur pour la région contenant les 5 SNPs candidats. L’haplotype à risque correspondant aux allèles majeurs a un effet promoteur moins élevé que l’haplotype correspondant aux allèles mineurs. En revanche l’activité amplificateur est plus élevée pour l’haplotype à risque avec les allèles majeurs. Ces résultats suggèrent que cette région ayant un effet promoteur aurait aussi une fonction amplificateur (epromoter) et que l’effet régulateur est allèle dépendant. Dans les cellules K562 dans lesquelles nous avons enlevé la région contenant les SNPs avec la technologie CRISPR-Cas9, l’expression du gène ATP2B4 est moins élevée que dans les cellules sauvages. Ce résultat est significatif à la fois pour l’expression globale de tous les transcrits mais aussi spécifiquement pour les deux longs transcrits confirmant ainsi la fonction promoteur et amplificateur de cette région. Nous avons également montré par cytométrie en flux que cette délétion a pour effet une augmentation significative du calcium intracellulaire. En conclusion, nous avons identifié une région avec un effet promoteur et amplificateur dont l’effet sur l’expression d’ATP2B4 varie en fonction des allèles des SNPs associés aux FGs. Ainsi nos résultats permettent de proposer de nouvelles stratégies thérapeutiques basées sur la modulation de l’expression d’ATP2B4 et du calcium intracellulaire.

Malaria causes approximately one million fatalities per year, mostly among Africa. The severity of the disease is influenced by complex interactions between many factors including host genetics. My thesis work concerns the identification and the functional characterization of the genetic variants involved in resistance/susceptibility to severe malaria (SM) by combining bioinformatics and genetic approaches. Several GWAS of SM have identified various loci. Nevertheless, only a limited number of loci and genetic variants have been replicated in independent populations. The first part of my project was to systematically identify the regulatory effect of all the SNPs in linkage disequilibrium (LD) with the tagSNPs associated with SM in several populations. By using different bioinformatics tools, we prioritized the potential causal variants and interestingly found 5 best candidates (rs11240734, rs1541252, rs1541253, rs1541254, and rs1541255) located close to each other on chromosome 1 in ATP2B4 region. Our bioinformatic results predicted that they have a regulatory effect, whereas the tagSNPs are unlikely functional. ATP2B4 is the main calcium pump of erythrocytes (the host cells of the pathogenic stage of malaria parasites) and alteration of its expression may affect the intraerythrocytic calcium concentration and thus the structure and development of intraerythrocytic stages of the parasite. By genotyping these SNPs in a Senegalese population, we confirmed the association of tagSNP (rs10900585) and the 5 candidates (major allele as the risk allele) with SM. Moreover, a meta-analysis confirmed the association of this tagSNP with SM in several populations. Furthermore, we have genotyped ATP2B4 variants (rs10751450, rs10751451, rs10752452) that have shown to be in an enhancer and to alter ATP2B4 expression and assessed their association with SM. Interestingly, we evidenced a close LD between these SNPs and rs11240734, rs1541252, rs1541253, rs1541254, and rs1541255, and detected a significant association with SM in the Senegalese population. Moreover, haplotype analysis revealed that the individuals homozygous for the major haplotype were found to have a higher risk of developing SM. In the next part, we investigated the functional impact of the candidate variants on gene regulation by using different functional approaches. Luciferase assay results indicated a significant promoter activity for both risk (major alleles) and the non-risk haplotype (minor alleles) with non-risk haplotype inducing higher transcriptional activity. Furthermore, the region showed a significant enhancer effect on the ATP2B4 promoter. However, the major haplotype (risk) exhibited significantly higher enhancer impact than minor haplotype (non-risk) which confirmed that the regulatory region exhibits allele-dependent enhancer activity in K562 and suggested that our regulatory region is an epromoter (promoter with enhancer function). Using CRISPR-Cas9, we performed the knockout of the region containing the SNPs and found a decrease in expression of the gene compared to WT for total expression as well as for two long transcripts, which confirmed that our regulatory region with rs11240734, rs1541252, rs1541253, rs1541254, and rs1541255 has an enhancer function. Additionally, the impact of deletion on intracellular calcium concentration was measured using flow cytometry and the results indicated a significant increase in intracellular calcium in deleted clones. In conclusion, we identified an enhancer that controls ATP2B4 expression and is perturbed by several genetic variants associated with severe malaria. This also fosters the development of therapeutic strategies based on the modulation of ATP2B4 expression and calcium levels.