Soutenance de thèse de SANKAR Shobana
Titre de thèse
Description et analyse fonctionnelle des microARNs au cours de la maturation neuronale chez la drosophile
microRNA dynamics and function during neurogenesis
Résumé de la thèse
Le développement du cerveau est un processus dynamique gouverné par de multiples mécanismes régulant spacialement et temporellement l'expression des gènes afin d'assurer la formation de connexions synaptiques précises. Cependant, les mécanismes qui ajustent finement l'expression des gènes et synchronisent la croissance entre différents neurones restent encore imparfaitement compris. Dans le système nerveux central de la drosophile, les neurones secondaires générés durant les stades larvaires maturent de manière coordonnée et progressive, depuis la métamorphose jusqu'aux stades tardifs de la pupe. Bien que l'hormone stéroïde Ecdysone coordonne le développement d'au moins un sous-ensemble de neurones, les mécanismes régulateurs plus larges de la maturation neuronale chez drosophile n'ont pas été étudiés.
Ainsi, mon projet de doctorat visait à comprendre le rôle des microARN (miARN) comme régulateurs post-transcriptionnels impliqués dans lmaturation synchronisée des neurones. Les miARN sont de petits ARN non codants qui se lient aux ARN messagers (ARNm) et répriment leur traduction en inhibant la traduction ou en induisant la dégradation des ARNm. En général, chaque miARN peut cibler des dizaines d'ARNm, tandis que chaque ARNm peut être, à son tour, ciblé par plusieurs miARN. Alors que la plupart des études sur les miARN se concentrent sur des interactions individuelles miARN-ARNm, l'implication globale des miARN dans le développement du cerveau reste peu connue. Par conséquent, dans mon projet de doctorat, nous avons isolés les miARN actifs au cours du développement de la drosophile et étudié leur rôle dans la maturation neuronale.
Nous avons tout d'abord caractérisé l'effet d'une abolition complète de la voie des miARN sur la maturation neuronale et observé une maturation précoce des neurites, suggérant que les miARN sont nécessaires pour interrompre la croissance des neurites aux stades précoces, laquelle reprend au début de la métamorphose. Pour identifier plus précisément les miARN actifs durant la maturation neuronale, nous avons utilisé une technique récemment établie, l'AGO-APP in vivo, pour isoler les miARN actifs des neurones depuis les stades larvaires tardifs jusqu'à l'âge adulte, puis nous les avons séquencés. Cela a permis de lister les miARN actifs et différentiellement exprimés au cours du développement neural. À partir de ces données, nous avons identifié un module de miARN enrichi chez les derniers stades larvaires, prédit pour cibler la voie de la morphogenèse des neurites, suggérant unrôle dans l'arrêt de la croissance des neurites afin d'éviter une maturation prématurée. Après avoir vérifié les profils d'activité des miARN selon les types cellulaires et les différents moments du développement à l'aide de lignées “sensors”, nous avons modifié l'expression des miARN de ce module et observé que la surexpression de miARN individuels entraîne de graves défauts de guidage axonal dans les neurones du corps champignon, et que l'inhibition du module de miARN provoque une croissance prématurée des neurites.
En conclusion, ce projet démontre que les miARN contribuent à la maturation neuronale. Il révèle également que des groupes de miARN présentant des profils d'activité similaires peuvent agir de manière coopérative en tant que modules pour contrôler des voies de signalisation clés de la maturation neuronale. De plus, l'ensemble de données de miARN généré constitue une ressource importante pour l'étude des fonctions des miARN dans les étapes ultérieures de la maturation neuronale. En cartographiant les miARN actifs à travers les stades du développement neuronal, ce projet fournit un point de départ pour comprendre comment des modules de miARN régulés temporellement contrôlent le processus progressif de maturation neuronale, révélant de nouveaux réseaux régulateurs qui affinent l'expression génique au cours du développement du cerveau.
Thesis resume
Brain development is a dynamic process governed by multiple mechanisms that regulate spatial and temporal gene expression to ensure the formation of precise synaptic connections. Yet, the mechanisms fine-tuning gene expression and synchronising growth across diverse neurons remain incompletely understood. In the Drosophila melanogaster central nervous system, secondary neurons generated during larval stages mature in a coordinated, stepwise manner from metamorphosis till the late pupal stages. While the steroid hormone ecdysone coordinates the development of at least a subset of neurons, broader regulatory mechanisms of neuron maturation in Drosophila have not been studied. Thus, my PhD project explored microRNAs as compelling post-transcriptional regulators of gene expression. MicroRNAs (miRNAs) are small non-coding RNAs that bind messenger RNAs (mRNAs) and repress their translation by inhibiting translation or mRNA degradation. Generally, each miRNA can target dozens of mRNAs, while individual mRNAs, in turn, are targeted by multiple miRNAs. While most studies on miRNAs across species focus on individual miRNA-mRNA interactions, they fail to capture the full scope of miRNA-mediated gene regulation in brain development. Therefore, in my PhD project, we systematically profiled active miRNAs during Drosophila development and investigated their role in neuronal maturation.
First, we characterised the effect of a complete loss of mature miRNAs on neuronal maturation and observed precocious neurite maturation, suggesting that miRNAs are required for the pausing of neurite growth in early stages, which resumes at the beginning of metamorphosis. To further identify active miRNAs during neuronal maturation, we used a recently established technique, in vivo AGO-APP, to isolate active miRNAs from neurons from late larval to adult stages and sequenced them. This generated a comprehensive dataset of active miRNAs that have a dynamic pattern across development. From this, we identified a module of miRNAs enriched in late larvae that is predicted to target the neurite morphogenesis pathway, suggesting their role in the pausing of neurite growth to prevent precocious maturation. After verifying the activity patterns of miRNAs across cell types and different developmental time points using sensors, we modulated the miRNA levels by misexpression. We observed that the overexpression of individual miRNAs leads to severe axon guidance defects in mushroom body neurons, and the knockdown of the miRNA module results in premature neurite growth.
In conclusion, this project demonstrates that miRNAs contribute to neuronal maturation and defines the landscape of active neuronal miRNAs during this developmental window. It further suggests that groups of miRNAs with similar activity patterns may act cooperatively as modules to control key pathways in neuron maturation. Additionally, the miRNA dataset generated is an important resource for investigating miRNA functions in later steps of neuron maturation. By mapping active miRNAs across stages of neuronal development, this project provides a starting point to shed light on how temporally regulated modules of miRNAs control the stepwise process of neuronal maturation, revealing novel regulatory networks that fine-tune gene expression during brain development.