Soutenance de thèse de KANDIYOTH Fabina Binth
Titre de thèse
Approches méthodologiques pour la reconstitution d'un renouvellement rapide de l'actine en conditions de type cellulaire
Novel tools to reconstitute rapid actin turnover into cell-like conditions
Résumé de la thèse
Le cytosquelette d'actine est un ensemble de réseaux complexes de filaments distribués dans le cytoplasme cellulaire. Ce cytosquelette est essentiel pour des fonctions cellulaires telles que la migration cellulaire, l'endocytose et la division cellulaire. Son fonctionnement repose sur un renouvellement rapide des filaments d'actine, en un processus cyclique comprenant leur polymérisation, leur désassemblage et le recyclage des sous-unités d'actine en monomères polymérisables de nouveau. Dans les cellules, ce renouvellement se produit à l'échelle de quelques secondes à quelques minutes, et est régulé par l'action coordonnée de multiples protéines liant l'actine (actin-binding proteins, ABPs). Notre compréhension de ces mécanismes est incomplet, et limite notre capacité de reconstituer divers processus cellulaires dépendants de l'actine, en particulier lors d'encapsulations de systèmes biomimétiques dans des microenvironnements de type cellulaire.
Comprendre mieux ces mécansimes moléculaires nécessite d'identifier des combinaisons et concentrations optimales d'ABPs capables de catalyser efficacement les différentes étapes du renouvellement de l'actine. Ceci est possible si une stratégie efficace et à haut débit permettant de comparer quantitativement les effets individuels et combinatoires des ABPs est mise en place. Au cours de ma thèse de doctorat, j'ai développé de nouveaux essais in vitro reposant sur une mesure précise de la dynamique d'échange des nucléotides liés à l'actine, ou sur une mesure de la consommation d'ATP de l'actine. À l'aide de ces essais sensibles, j'ai criblé les ABPs impliquées dans le désassemblage des filaments d'actine et le recyclage des monomères. J'ai déterminé l'activité de ces facteurs en fonction de leur concentration, et identifié des conditions optimales pour le renouvellement rapide des filaments d'actine. De plus, j'ai comparé l'efficacité des ABPs à forte concentration de F-actine, proches des niveaux cellulaires. J'ai enfin démontré que ce renouvellement rapide est conservé en conditions de confinement en encapsulant des systèmes d'actine optimisés dans des vésicules de taille cellulaire.
Dans l'ensemble, ce travail établit un cadre quantitatif pour la reconstitution d'un renouvellement rapide de l'actine dans des environnements confinés de type cellulaire et fournit une base pour la reconstruction de processus dynamiques dépendants de l'actine, tels que l'endocytose et la division cellulaire, dans des vésicules dotées de membranes déformables.
Thesis resume
The actin cytoskeleton is a complex network of filaments distributed throughout the cell cytoplasm. This cytoskeleton mediates essential cellular functions such as cell migration, endocytosis and cell division. Its efficiency relies on rapid renewal of actin filaments in a cyclic process involving their polymerization, disassembly and recycling of actin subunits into polymerizable monomers. In cells, this turnover can occur on timescales of few seconds to few minutes and is tightly regulated by the coordinated action of multiple actin binding proteins (ABPs). Our understanding of these mechanisms is incomplete, limiting our ability to reconstitute various actin-based cellular processes, particularly when encapsulating these biomimetic systems into cell like microenvironments.
A better understanding of these molecular mechanisms requires identifying the optimal combinations and concentrations of ABPs capable of efficiently catalyzing the various steps of actin turnover. This is possible if an efficient and high-throughput strategy is implemented to characterize and compare the individual and combinatorial effects of ABPs. During my PhD, I developed novel in vitro assays based of the exchange dynamics of actin-bound nucleotides, or on measurement of actin ATP consumption. Using these sensitive assays, I screened ABPs involved in actin disassembly and recycling. I determined the activity of these factors as a function of their concentration and identified optimal conditions for rapid filament turnover. In addition, I compared the efficiency of these proteins at high F-actin concentration, close to cellular levels. Finally, I demonstrated that rapid turnover is maintained under confined conditions by encapsulating optimized actin system into cell-sized vesicles.
Overall, this work establishes a quantitative framework for reconstituting rapid actin turnover in confined, cell-like environments and provides a foundation for reconstituting various actin-based dynamic processes such as endocytosis and cell division, in vesicles with deformable membranes.