Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Biologie du Développement

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

récepteur tyrosine kinase,gènes impliqués dans le cancer : oncogènes,initiation de la tumorigenèse,modèle de souris,utagenèse par insertion de transposon,

Keywords

receptor tyrosine kinase,cancer gene discovery,tumour initiation,mouse model,transposon mutagenesis screen,

Titre de thèse

Explorer la coopération entre les gènes en intéraction avec les RTKs au cours de l'initiation de la tumorigénèse hépatique et de son évolution
Evaluating the landscape of genes cooperativity with RTKs in liver tumorigenesis and its evolution

Date

Lundi 16 Mars 2020

Adresse

Amphitheatre 12, Batiment B Aix-Marseille Université – CNRS UMR7288 163 Avenue deLuminy, case 907 - 13009 Marseille Amphitheatre 12

Jury

Directeur de these M. Flavio MAINA IBDM - Team: “Signalling networks for stemness and tumorigenesis”
Rapporteur Mme Almudena PORRAS GALLO Dpto. Bioquímica y Biología Molecular, Facultad Farmacia, Complutense University from Madrid
Rapporteur Mme Angela MARTINEZ VALVERDE Instituto de Investigaciones Biomédicas
S 901 INMED) - Aix Marseille University Valery MATARAZZO Institut de Neurobiologie de la Méditerranée (UMR

Résumé de la thèse

L'objectif principal de mes recherches était d'identifier des mécanismes coopérant avec les récepteurs tyrosine kinases et impliqués fonctionnellement dans la tumorigenèse. Centrée sur le cancer du foie, ma recherche peut être subdivisée en trois projets complémentaires. Le 1er projet était lié à la découverte par mon laboratoire d'un nouveau mécanisme épigénétique assurant la surexpression des gènes par hyperméthylation d'îlots CpG. Je me suis concentrée sur 6 gènes candidats. J'ai exploré leur rôle en tant qu'oncogènes en effectuant des tests de croissance indépendante de l'ancrage (gélose molle), de croissance dépendante de l'ancrage (formation de foyers) et de xénogreffes. J'ai ainsi montré qu'une diminution du niveau d'expression de ces gènes, grâce à l'utilisation de shRNA spécifiques, réduit la tumorigénicité des cellules d'hépatocarcinome (CHC). Ces résultats ont démontré que les gènes surexprimés suite à une hypermethylation de CGI présent dans le corps génique agissent ensemble comme un "module oncogène". Ainsi, l'hyperméthylation des CGI du corps génique permettrait de prédire des niveaux élevés d'expression d'oncogènes; ce qui offre une nouvelle stratégie de stratification et des perspectives pour normaliser le niveau d'expression des gènes du cancer. Le 2e projet visait à identifier des gènes capables de coopérer avec les RTK lors de l'initiation de tumeurs hépatiques. La mutagenèse insertionnelle de type "transposon Sleeping Beauty" a été utilisée par le laboratoire pour accélérer la formation de tumeurs hépatiques chez les souris Alb-R26Met, un contexte génétique dans lequel une augmentation subtile des niveaux du RTK MET prédisposent à la tumorigenèse. Cette étude nous a permis d'identifier 275 gènes présumés liés au cancer. Grâce à l'analyse bioinformatique, j'ai prédit les réseaux d'interaction protéine-protéine entre les gènes identifiés et découvert l'enrichissement en signaux spécifiques et fonctions cellulaires. De façon inattendue, ces gènes n'étaient pas seulement limités à un petit ensemble de processus cellulaires et de voies de signalisation spécifiques, mais couvraient un large spectre de fonctions cellulaires, y compris la régulation du cycle cellulaire, la dégradation de l'ARNm, l'ubiquitination, le protéasome, le métabolisme, la séparation des chromatides et le remodelage chromatinien. J'ai validé 15 candidats suppresseurs de tumeurs, car le ciblage de l'ARN par shRNA conférait une capacité tumorale aux cellules sensibilisées aux RTK (hépatocytes immorto-R26Met), mais pas aux cellules présentant un niveau basal de RTK (hépatocytes immorto-WT). Ces résultats démontrent qu'une augmentation du niveau d'expression de RTK est un contexte essentiel pour leur rôle d'initiateur de tumeurs. Nos travaux ont ainsi permis d'identifier des interactions génétiques, non anticipées, qui sous-tendent la coopération génétique avec les RTK dans le CHC. De plus, nos résultats montrent comment l'augmentation subtile des taux de RTK de type sauvage créé un contexte permettant à de multiples mécanismes dérégulés d'initier le cancer du foie. Le 3e projet portait sur ADAMTSL5, un gène que nous avons trouvé surexprimé et hyperméthylé dans les CGI présents dans le corps du gène, aussi bien dans le cas des CHC Alb-R26Met que chez une forte proportion de patients humains atteints de CHC. ADAMTSL5 est une protéine sécrétée, dont le rôle dans le cancer était totalement inconnu. Pour explorer l'implication d'ADAMTSL5 dans la tumorigenèse, j'ai effectué des études de perte et de gain de fonction. La régulation à la baisse d'ADAMTSL5 par des shRNA ciblant l'ARN dans les cellules CHC altère leurs propriétés tumorigènes aussi bien in vitro qu'in vivo. A l'inverse, la surexpression d'ADAMTSL5 confère une capacité tumorigène aux hépatocytes génétiquement sensibilisés et non transformés. Collectivement, ces résultats démontrent qu'ADAMTSL5 est un nouveau biomarqueur du CHC et un régulateur clé de la tumorigénicité cellulaire.

Thesis resume

The main objective of my research was to identify mechanisms cooperating with Receptor Tyrosine Kinases (RTKs) and functionally implicated in tumorigenesis. Focusing on liver cancer, my research can be subdivided in three complementary projects. The first project was linked to the discovery by my lab of a new epigenetic mechanism ensuring overexpression of genes through gene body CpG island (CGI) hypermethylation. Focussing on 6 candidate genes, I explored their role as oncogenes by performing anchorage-independent growth (soft agar) assay, anchorage-dependent growth (foci formation) assay, and xenografts. I showed that downregulation of the expression levels of these genes with shRNA targeting sequences reduced tumorigenicity of HCC cells. These results demonstrated that genes overexpressed and with hypermethylated gene body CGIs act together as an “oncogene module”. Thus, hypermethylation of gene body CGIs is predictive of elevated oncogene levels in cancer, offering a novel stratification strategy, and perspectives to normalize cancer gene dosages. The second project aimed at searching for genes capable to cooperate with RTKs during liver tumour initiation. The Sleeping Beauty transposon insertional mutagenesis was employed by the lab to accelerate liver tumour formation in Alb-R26Met mice, a genetic context in which subtly increased MET RTK levels predispose towards tumorigenesis. This screen allowed us to identify 275 genes putatively related to cancer. Through bioinformatics analysis, I predicted networks of protein-protein interaction among identified genes and uncovered enrichment of pathways and cellular functions. Unexpectedly, these genes were not only restricted to a small set of specific pathway/cellular processes, but were covering a large spectrum of cellular functions, including signalling cell cycle regulation, mRNA degradation, ubiquitination, proteasome, metabolism, chromatid segregation, and chromatin remodelling. I validated 15 tumour suppressor candidates, as shRNA mediated targeting conferred tumorigenicity to RTK-sensitized cells (immorto-R26Met hepatocytes), but not to cells with basal RTK levels (immorto-WT hepatocytes).This demonstrates that the context of enhanced RTK levels is essential for their action in tumour initiation. Our study identifies unanticipated genetic interactions underlying gene cooperativity with RTKs in HCC. Moreover, our results show how subtly increased levels in wild-type RTKs provides a permissive context allowing multiple deregulated mechanisms to initiate liver cancer. The third project was related to ADAMTSL5, a gene we found overexpressed and hypermethylated in gene body CGI both in Alb-R26Met HCC and in a high proportion of human HCC patients. ADAMTSL5 is a secreted protein, which role in cancer was fully unknown. To explore ADAMTSL5 implication in tumorigenesis, I performed loss- and gain-of-function studies. ADAMTSL5 downregulation with shRNA targeting sequences in HCC cells interfered with their tumorigenic properties both in vitro and in vivo. Instead, overexpression of ADAMTSL5 conferred tumorigenic capability to genetically sensitized, non-transformed hepatocytes. Collectively, these outcomes demonstrate that ADAMTSL5 is a new HCC biomarker and a key regulator of cell tumorigenicity.