Soutenance de thèse de BENACHIR Assia
Titre de thèse
Méthodes et instrumentation pour la microscopie de fluorescence à un et deux photons par illumination aléatoire
Methods and instrumentation for single and two-photon fluorescence random illumination microscopy
Résumé de la thèse
La microscopie de fluorescence est un outil essentiel pour la recherche biologique et
médicale, grâce à la grande diversité des marqueurs fluorescents disponibles, ainsi
qu'à leur haute spécificité et sensibilité. La microscopie en champ large, où l'ensemble
du champ de vision est illuminé simultanément, est avantageuse en raison de sa
simplicité technique et sa rapidité d'acquisition. Cependant, elle ne permet pas le sectionnement optique, c'est-à-dire la capacité de distinguer différents plans au sein d'un
échantillon en trois dimensions. Les techniques de microscopie à balayage, en particulier
en fluorescence à deux photons, permettent le sectionnement optique, mais
présentent une limitationmajeure. En effet, pour augmenter la vitesse d'acquisition
sans dégrader le niveau de signal, il est nécessaire d'augmenter la puissance laser
utilisée pour l'excitation, ce qui augmente les risques de dommages à l'échantillon et
de photoblanchiment.
Dans le cadre de ce travail de thèse, nous proposons de nouvelles approches expérimentales pour la microscopie de fluorescence en champ large avec sectionnement
optique. Nous appliquons les techniques Dynamic Speckle Illumination (DSI) et
RandomIlluminationMicroscopy (RIM), qui reposent sur l'utilisation d'illuminations
aléatoires sous la forme de speckle laser. Elles permettent d'obtenir des images avec
un sectionnement optique jusqu'à 2 μm, sur un large champ de vision de 250 μm.
L'algorithme de super-résolution RIM permet également une amélioration de la résolution
latérale d'un facteur deux, tout en conservant un montage expérimental simple
et robuste au désalignment.
Dans un premier temps, nous démontrons qu'un diffuseur à cristaux liquides nématiques
dopé aux zwitterions permet de contrôler précisément la vitesse de décorrélation
des speckles, sur une large plage de valeurs. Cet instrument nous permet
d'obtenir des images en champ large avec sectionnement optique, et un taux
d'acquisition jusqu'à 14 Hz.
Dans un deuxième projet, l'absorption à deux photons permet de pénétrer plus profondément dans les tissus biologiques. A l'aide d'une source accordable en longueur
d'onde, nous démontrons également l'acquisition d'images multicolores en champ
large.
Enfin, nous réalisons la première démonstration de DSI par détection événementielle,
qui permet un sectionnement optique sans post-traitement nécessaire.
Ces avancées technologiques apportent des outils innovants et ouvrent de nouvelles
perspectives pour la microscopie en champ large avec sectionnement optique,
appliquée à l'imagerie biologique et biomédicale.
Thesis resume
Fluorescence microscopy is an essential tool for biological and medical imaging
applications, owing to the wide choice in fluorescent labels, their high specificity,
and sensitivity. Widefield imaging, where the entire field of view is illuminated at
once, benefits from its technical simplicity and high acquisition speed. However, it
lacks optical sectioning, i.e. the capability of distinguishing between planes inside
a three-dimensional sample. Point-scanning approaches, particularly two-photon
fluorescence, enable optical sectioning, but at a cost. Indeed, increasing the acquisition
speed while retaining a high signal to noise ratio requires higher excitation laser
power, which in turn increases the risks of photodamage and photobleaching.
In this PhD work, we propose novel experimental approaches for single and twophoton
fluorescence widefield optical sectioning microscopy. Using random speckle
illumination, we apply two widefield techniques, Dynamic Speckle Illumination (DSI)
and RandomIlluminationMicroscopy (RIM), to achieve optical sectioning down to
2 μm, over large fields of view of up to 250 μm. In addition to that, the RIM superresolution algorithm enables a two-fold lateral resolution improvement, while keeping the experimental setup straightforward and robust to misalignment.
First, we show that a zwitterion-doped nematic liquid crystal diffuser allows for precise and highly tunable control of the speckle decorrelation speed. Matching the speckle speed to the exposure time of the camera, we are able to demonstrate widefield
fluorescence DSI imaging, with an imaging rate up to 14 Hz.
In a second project, we make use of two-photon excitation to achieve deeper penetration
into biological tissues. We also demonstrate multicolour widefield imaging over a large field of view using two-photon RIM, and imaging of thick and scattering media over large fields of view.
Finally, we make the first demonstration of event-based DSI. Using event-based
detection and random speckle illumination, we obtain optical sectioning from the
acquisition, without requiring any post-processing.
These technical and technological advances offer new tools and open new perspectives
for high speed widefield optical sectioning microscopy applied to biology and
the biomedical field.