Soutenance de thèse de BOISGARD Rémy
Titre de thèse
Développement de molécules théranostiques à base de nanobodies pour cibler les cancers surexprimant la mésothéline
Development of theranostic antibody-like molecules using nanobodies to target cancers overexpressing mesothelin
Résumé de la thèse
En cancérologie, l'approche théranostique repose sur l'intégration de fonctions diagnostiques et thérapeutiques au sein d'un même système moléculaire ou d'un couple d'agents structurellement apparentés ciblant un antigène tumoral commun. Cette stratégie, inscrite dans le cadre de la médecine personnalisée, permet l'identification d'une cible, l'administration d'une thérapie ciblée et le suivi spatio-temporel de l'évolution tumorale. Pour de telles applications, les anticorps monoclonaux présentent des limitations, notamment une masse moléculaire élevée, une diffusion tissulaire restreinte et un potentiel immunogène non négligeable. En réponse à ces contraintes, les nanobodies, fragments monovalents dérivés des anticorps à chaînes lourdes uniques de camélidés, constituent une alternative. Leur faible taille, leur forte affinité, leur bonne pénétration tissulaire et leur flexibilité d'ingénierie permettent la conception de dispositifs théranostiques efficaces et modulables.
Pour ce projet de thèse, la mésothéline a été sélectionnée comme cible en raison de sa surexpression dans plusieurs cancers agressifs et de sa faible expression dans les tissus sains. Deux nanobodies dirigés contre cet antigène tumoral, A1 et S1, ont été sélectionnés et caractérisés. Bien que leur affinité pour la mésothéline soit comparable, A1 reconnaît un épitope commun à celui reconnu par la mucine 16, principal ligand de la mésothéline, tandis que la liaison du nanobody S1 reste indépendante de cette interaction.
À partir de ces deux nanobodies, des agents d'imagerie et des engageurs de cellules immunitaires ont été ingéniérés. Pour l'imagerie, plusieurs agents aux propriétés distinctes (format, taille, valence, demi-vie) ont été développés. Leur capacité de ciblage a été évaluée in vitro en 2D (bio-layer interferometry, cytométrie en flux) et en 3D (sphéroïdes tumoraux multicellulaires), ainsi qu'in vivo sur des modèles murins xénogreffés. Pour la thérapie, plusieures molécules ciblant les lymphocytes T ou les cellules NK ont été développées. Leur affinité et leur capacité à induire une lyse tumorale et la sécrétion de cytokines ont été évaluées par bio-layer interferometry, cytométrie en flux, CellTiter-Glo, iCelligence et ELISA. Un modèle d'exhaustion des lymphocytes T a été mis en place afin d'évaluer leur efficacité en contexte immunosuppresseur.
En imagerie, les formats bivalents ont présenté une meilleure affinité fonctionnelle et une pénétration accrue dans les sphéroïdes. In vivo, l'ajout d'un module d'extension de demi-vie a permis une meilleure accumulation tumorale et une réduction du marquage hors tumeur. En thérapie, la position des nanobodies dans les formats collier de perles a influencé leurs propriétés, une position C-terminale a systématiquement induit une diminution des capacités de liaison. Les formats induisant une lyse tumorale accrue ont été associés à une sécrétion plus importante de cytokines.
Ces travaux ont démontré la faisabilité d'une stratégie théranostique utilisant des nanobodies, identifié des paramètres structuraux clés de la performance fonctionnelle et ont fourni une base pour l'optimisation d'agents théranostiques en cancérologie.
Thesis resume
In oncology, the theranostic approach is based on the integration of diagnostic and therapeutic functions within a single molecular system or a pair of structurally related agents targeting a common tumor antigen. As part of personalized medicine, this strategy enables the identification of a target, the administration of a targeted therapy, and the spatio-temporal monitoring of tumor evolution. For such applications, monoclonal antibodies present several inherent limitations, including their substantial molecular mass, limited tissue diffusion, and significant immunogenicity. To overcome these constraints, nanobodies, monovalent fragments derived from camelid heavy-chain only antibodies, have emerged has an alternative. Their small size, high affinity, good tissue penetration and engineering flexibility enable the design of effective and scalable theranostic devices.
For this thesis project, mesothelin was selected as the target due to its overexpression in several aggressive cancers and limited expression in healthy tissues. Two nanobodies targeting this tumor associated antigen, designated A1 and S1, were selected and characterized. While their affinity for mesothelin is similar, A1 recognizes an epitope located in the same binding pocket with that of mucin 16, the main ligand of mesothelin. In contrast, the binding of nanobody S1 remains independent of this interaction.
Based on these two nanobodies, imaging agents and immune cell engagers were engineered. For imaging applications, several agents were developed with distinct properties (format, size, valency, half-life). The targeting capacity of the nanobody-based imaging agents was assessed in vitro in 2D by bio-layer interferometry and flow cytometry, and in 3D on multicellular tumor spheroids. In vivo studies were carried out on xenografted mouse models. For the immunotherapeutic approach, T-cell engagers and NK cell engagers were developed. The binding affinity, ability to mediate tumor lysis, and induced cytokine release were assessed by bio-layer interferometry, flow cytometry, CellTiter-Glo, iCelligence, and ELISA. A T-cell exhaustion model was also established to evaluate efficacy under immunosuppressive conditions.
In imaging applications, bivalent formats demonstrated increased functional affinity and improved penetration into tumor spheroids. In vivo, the incorporation of a half-life extension module led to increased tumor accumulation and reduced off-target labeling. In immunotherapeutic constructs, the positioning of nanobodies within the pearl necklace format significantly influenced their functional performance, with C-terminal placement reducing binding affinity. Formats that induced stronger tumor lysis were also associated with higher levels of cytokine release.
This work demonstrated the feasibility of a nanobody-based theranostic strategy, identified key structural parameters of functional performance, and provided a foundation for the optimization of next-generation theranostic agents in oncology.