Soutenance de thèse de MILLET WALLISKY Ewa

Résumé de la thèse

La cytométrie en flux (CMF) permet l'analyse multiparamétrique de particules d'origine cellulaire ou synthétiques. Elle est utilisée pour des analyses phénotypiques et fonctionnelles. Le liquide céphalo-rachidien (LCR) est un liquide biologique produit par les plexus choroïdes et le liquide interstitiel, libéré par les cellules neurales. Il contient (1) des cellules immunes recrutées au niveau des plexus choroïdes qui participent à l'immuno-surveillance et au maintien de l'homéostasie tissulaire et (2) des vésicules extracellulaires (VEs) libérées par les cellules neurales et du LCR, drainées dans le LCR et dans le sang par voie lymphatique.
La CMF est utilisée en routine hospitalière pour la détection dans le LCR de cellules lymphomateuses. L'analyse des cellules immunes du LCR est encore peu utilisée en routine pour les autres pathologies du système nerveux central (SNC). Le LCR contient en effet peu de cellules et doit être traité rapidement après la ponction lombaire. Nous avons développé un protocole de marquage avec différents panels séchés d'anticorps marqués, en un temps, rapide, sans centrifugation ni étapes de lavage. Ce protocole limite les biais pré-analytiques et analytiques, et la perte d'information notamment concernant les cellules myéloïdes. Ce protocole inclut une fixation faible qui permet la conservation du marquage cellulaire sur trois jours, le rendant applicable au lit du patient et aux études multicentriques.
J'ai ensuite appliqué ce protocole avec trois panels d'anticorps sur 650 échantillons de LCR de patients souffrant de différentes pathologies du système nerveux. J'ai principalement analysé l'apport potentiel des données obtenues en les combinant avec d'autres biomarqueurs solubles applicables en routine dans deux domaines médicaux, la Sclérose en Plaques (SEP) et les maladies neurodégénératives dont la maladie d'Alzheimer (MA). L'analyse des biomarqueurs du LCR est majeure pour le diagnostic et l'évaluation pronostique de la SEP. Elle porte sur les différents marqueurs de synthèse intrathécale (SIT) d'immunoglobulines. L'augmentation des cellules B et des plasmablastes observée est cependant accrue lorsque la ponction lombaire est réalisée à proximité d'une poussée clinique. Enfin, en fonction du profil de SIT, les marqueurs cellulaires prédictifs d'évolution sévère sont positivement corrélés avec une SIT IgM et les chaines légères libre Kappa, mais pas les lambda. Dans le cadre des maladies neurodégénératives, c'est notamment l'analyse des monocytes qui représentent un intérêt. L'expression d'un marqueur de signature IFN de type I, le CD169, et de CD54 est plus importante dans les formes à début précoces de la MA. L'analyse combinée des cellules du LCR avec d'autres biomarqueurs permet de décrire une stratification biologique de la cohorte MA. Dans le cadre de la médecine personnalisée ciblant la neuro-inflammation, il serait intéressant d'observer l'évolution de la maladie pour déterminer s'il est possible d'associer ces profils à des évolutions différents de la maladie.
L'analyse directe des VEs nanométriques dans le LCR est possible en CMF avec le Cytoflex (Beckman Coulter Immunotech). L'accès très récent au Cytoflex nano m'a permis d'illustrer la présence de différentes nanoparticules portant des marqueurs immunologiques. Cependant, au stade du développement technologique, les informations obtenues sont limitées par comparaison avec celles obtenues par analyse en CMF après capture des VEs sur des billes fluorescentes analysables sur des cytomètres classiques. L'analyse des VEs est majoritairement le reflet des modifications des cellules neurales que des cellules immunes du LCR. L'avantage de l'analyse des VEs est représenté par la possibilité de réaliser des analyses rétrospectives avec des LCR centrifugées et conservés à -80°C contrairement aux cellules qui doivent être analysées directement après le prélèvement.