Soutenance de thèse de BACA PORCEL Angel
Titre de thèse
Caractérisation et valorisation biotechnologique d'enzymes formant des hydrocarbures chez les algues et les plantes
Hydrocarbon-forming enzymes in algae and plants and their uses in biotechnological studies
Résumé de la thèse
Les hydrocarbures ont une large gamme d'applications selon la longueur de leur chaîne : les hydrocarbures à chaîne courte (C1–C4) sont utilisés pour le chauffage et la synthèse chimique ; ceux à chaîne moyenne (C5–C12) dans les solvants, l'essence et le kérosène ; ceux à chaîne longue (C13–C19) dans le diesel et les carburants pour centrales électriques ; et les hydrocarbures à très longue chaîne (≥ C20) sont utilisés comme lubrifiants, carburants marins, cires et composants de matériaux goudronneux. Les hydrocarbures sont presque exclusivement issus de ressources fossiles (pétrole, gaz naturel). Le pétrole et le gaz naturel étant des ressources limitées, des méthodes alternatives de production d'hydrocarbures doivent être développées. Certains organismes (plantes, algues, insectes et bactéries) synthétisent naturellement des hydrocarbures à partir d'acides gras ou de leurs dérivés grâce à des enzymes spécifiques. Ces enzymes peuvent être introduites dans diverses souches microbiennes industrielles afin de permettre une production d'hydrocarbures à haut rendement. Dans la première partie de ma thèse, j'ai développé une bioprocessus pour la production de n-heptane, un hydrocarbure à chaîne moyenne. Pour cela, nous avons modifié génétiquement des souches de E. coli en y introduisant une thioestérase et une enzyme algale productrice d'hydrocarbures appelée photodécarboxylase d'acides gras. La thioestérase interrompt l'élongation des acides gras, permettant à la bactérie de produire de l'acide n-octanoïque, qui est ensuite converti en n-heptane par la photodécarboxylase. Après cette étape d'ingénierie des souches, deux stratégies ont été testées pour optimiser la production de n-heptane. Dans la première, la thioestérase et la photodécarboxylase étaient co-exprimées dans la même souche, permettant la production et la conversion simultanées de l'acide n-octanoïque en n-heptane. Dans la seconde, deux souches séparées ont été utilisées : l'une exprimant la thioestérase, l'autre la photodécarboxylase. Dans ce système, l'acide n-octanoïque produit par la première souche servait de substrat à la seconde pour produire du n-heptane. Après avoir testé les deux approches, nous avons constaté que la co-culture de deux souches spécialisées surpassait la stratégie de co-expression dans une seule souche. Nous avons ensuite mis en œuvre cette approche de co-culture dans un bioréacteur de 100 mL. Ce procédé a permis d'obtenir 272 mg·L⁻¹ de n-heptane après 56 heures de culture. Les différentes enzymes responsables de la production d'hydrocarbures sont largement étudiées et utilisées en biotechnologie. La découverte et la caractérisation de nouvelles enzymes productrices d'hydrocarbures pourraient permettre de développer des souches plus efficaces. Chez les plantes, les protéines CER1 et CER3 font partie d'un complexe impliqué dans la biosynthèse d'hydrocarbures à très longue chaîne. Chez la plupart des microalgues, la production d'hydrocarbures est assurée par la photodécarboxylase d'acides gras. Cependant, certaines microalgues possèdent un homologue unique de CER1 et CER3, désigné ici par CER1/3. La fonction de cette protéine CER1/3 algale restait jusqu'à présent inexplorée. Dans cette partie de la thèse, j'ai caractérisé ce homologue CER1/3. Après avoir exprimé des homologues de CER1/3 issus de différentes espèces d'algues dans la levure, nous avons observé que cette protéine est capable de produire seule des hydrocarbures à longue chaîne, contrairement aux protéines végétales CER1 et CER3, qui doivent agir ensemble. De plus, nous avons découvert que la protéine végétale CER3 peut fonctionner avec les protéines algales CER1/3 pour produire des hydrocarbures à très longue chaîne. Ces résultats suggèrent que les protéines végétales CER1 et CER3, dotées de spécialisations biochimiques distinctes, proviendraient d'une protéine ancestrale bifonctionnelle algale CER1/3, issue d'une duplication génique chez les ancêtres des plantes.
Thesis resume
Hydrocarbons have a wide range of applications depending on their chain length: short-chain hydrocarbons (C1–C4) are used for heating and chemical synthesis; medium-chain (C5–C12) in solvents, gasoline, and jet fuel; long-chain (C13–C19) in diesel and power plant fuel; and very long-chain hydrocarbons (≥ C20) serve as lubricants, ship fuels, waxes, and components of tar materials. Hydrocarbons are almost exclusively obtained from fossil resources (e.g., petroleum and natural gas). However, fossil fuel use releases greenhouse gases that cause global warming and harm ecosystems. Petroleum and natural gas are finite resources, so alternative methods for hydrocarbon production must be developed. Some organisms, such as plants, algae, insects, and bacteria, naturally synthesize hydrocarbons from fatty acids or their derivatives using specific enzymes. These enzymes can be introduced into various industrial microbial strains to enable hydrocarbon production at high yields. However, most of these industrial strains do not contain fatty acids shorter than 12 carbons, making the microbial production of medium-chain and short-chain hydrocarbons more difficult. In the first part of my thesis, I developed a proof of concept for the production of n-heptane, a medium-chain hydrocarbon. To this end, we engineered E. coli strains by introducing a thioesterase and an algal hydrocarbon-producing enzyme called fatty acid photodecarboxylase. The thioesterase interrupts fatty acid elongation, enabling the bacterial strain to produce n-octanoic acid, which is then converted into n-heptane by fatty acid photodecarboxylase. After the microbial strain engineering, two strategies to optimize n-heptane production were used. In the first strategy, the thioesterase and the fatty acid photodecarboxylase were co-expressed in the same strain, allowing simultaneous production and conversion of n-octanoic acid into n-heptane. In the second strategy, two separate strains were used—one expressing the thioesterase and the other expressing the fatty acid photodecarboxylase. In this setup, the n-octanoic acid produced by the first strain served as a substrate for the second strain to produce n-heptane. After testing both approaches, we found that the co-cultivation of two specialized strains outperformed the co-expression strategy within a single strain. Then, we implemented the co-cultivation approach in a 100-mL bioreactor. This bioprocess yielded 272 mg.L-1 of n-heptane after 56 hours of cultivation, with a productivity of 4.9 mg.L-1.h-1. The various enzymes responsible for hydrocarbon production belong to different protein families and have been widely studied and used in biotechnology. Discovering and characterizing new hydrocarbon-producing enzymes could enable the development of more efficient hydrocarbon-producing strains. In land plants the proteins CER1 and CER3 are components of a complex that mediates the biosynthesis of very long-chain hydrocarbons. In most microalgae, hydrocarbon production is mediated by the fatty acid photodecarboxylase enzyme. However, some microalgae possess a single CER1 and CER3 homolog, referred to hereafter as CER1/3. The function of this CER1/3 in these microalgae remains unexplored. Thus, in this part of my thesis, I characterized this algal CER1/3 protein homolog. After expressing CER1/3 protein homologs from different algal species in yeast, we observed that CER1/3 mediates long-chain hydrocarbon biosynthesis by itself, unlike plant CER1 and CER3, which need to act together to mediate hydrocarbon production. Additionally, we found that the plant protein CER3 can function in conjunction with algal CER1/3 proteins to produce very long-chain hydrocarbons. These results suggest that the land plant proteins CER1 and CER3, with their distinct biochemical specializations, likely evolved from a single bifunctional algal CER1/3 protein through gene duplication in the ancestors of land plants.