Soutenance de thèse de Caroline DELEHEDDE

Le stress oxydant se définit par un déséquilibre entre la production d’Espèces Réactives de l’Oxygène (ERO) et les capacités cellulaires antioxydantes. Bien que certaines de ces espèces soient indispensables au bon fonctionnement du métabolisme par leur rôle de messagers cellulaires, elles sont aussi impliquées dans de nombreuses pathologies quand leur formation n’est plus régulée. Dès lors, l’étude du stress oxydant se révèle très importante pour permettre d’adapter les traitements aux mécanismes d’action de ces ERO. Depuis plus d’un demi-siècle, la technique du spin-trapping couplée à la Résonance Paramagnétique Electronique (RPE) permet l’observation de radicaux non persistants via des spectres de résonance caractéristiques. Les nitrones constituent une classe de composés portant la fonction C=N+-O- et sont très utilisées en spin trapping puisque les radicaux libres s’additionnent sur le carbone électrophile de leur double liaison pour former des adduits nitroxydes >N-O• plus persistants et le plus souvent détectables par RPE. De nombreuses nitrones ont été synthétisées parmi lesquelles l’α-phényl-N-tert-butylnitrone (PBN) et ses nombreux dérivés, une nitrone linéaire, qui en plus de ses remarquables capacités de piégeur d’ERO a également démontré des propriétés pharmacologiques intéressantes vis-à-vis de pathologies liées au stress oxydant. Puisque la mitochondrie est l’organelle la plus impliquée dans la production des ERO intracellulaires, un premier dérivé de la PBN vectorisé avec le cation triphénylphosphonium (TPP) a été proposé dans la littérature. Cette nitrone (mitoPBN), capable de s’accumuler au sein de la matrice mitochondriale, a été utilisée afin de détecter et/ou inhiber les radicaux libres au niveau de leur source de production, mais s’est cependant révélée cytotoxique à faible concentration, ceci constituant un écueil pour son utilisation. Dans ce contexte, nous avons entrepris dans le premier volet de ce travail, de synthétiser une nouvelle série de nitrones (mitoPPNs), qui sont des dérivés β-phosphorylés de la PBN, en utilisant différents vecteurs mitochondriaux autres que le cation TPP et en faisant varier la longueur de la chaine carbonée, dans le but de réduire la cytotoxicité, de moduler la lipophilie, d’améliorer la biocompatibilité, et ainsi permettre une utilisation facilitée en milieu biologique. Une étude par RPE a été ensuite menée sur ces nouveaux composés afin de déterminer leur réactivité in vitro sur plusieurs types de radicaux d’intérêt biologique, centrés sur l’oxygène, le carbone et l’azote. Dans un second volet de ce travail, l’intérêt de ces mitoPPNs en tant qu’outils pour l’élucidation de mécanismes cellulaires liés au stress oxydant a été évalué par leur utilisation sur un projet d’étude du mécanisme d’action de nouvelles molécules anticancéreuses également développées dans ce projet. Pour ce faire, partant du principe que les ERO jouent un rôle majeur dans le développement du cancer et que les thérapies en lien avec la régulation du stress oxydant sont en plein essor, et tenant compte d’autre part de l’intérêt récent de la metformine (un traitement standard du diabète de type II) dans la lutte contre le cancer, une série de composés hybrides a été développée dans le but d’associer des propriétés anticancéreuses et antioxydantes sur un même composé. Pour la partie antioxydante des hybrides, les molécules parentes ont été sélectionnées parmi une série de polyphénols. Une étude de la cytotoxicité, des voies de signalisation impactées et de l’action de ces hybrides sur le stress oxydant a été menée sur différents types de cellules cancéreuses, notamment de glioblastome. Enfin, une première évaluation de l’affinité de cette série d’hybrides vis-à-vis de la barrière hémato-encéphalique a été réalisée par un test biochimique et a permis de mettre en évidence l’intérêt potentiel de deux composés de la série.

The oxidative stress is an imbalance between reactive oxygen species (ROS) production and cellular antioxidant potential. Some of these species may play a crucial role in cell signaling but also contribute to a variety of pathologies if their formation is uncontrolled. Therefore, the study of oxidative stress is relevant in order to adapt pharmacological treatments to ROS mechanisms. For more than half a century, the spin trapping/ electron paramagnetic resonance (EPR) coupling is used to study non-persistent radicals via their characteristic resonance spectra. Nitrones are a class of diamagnetic compounds bearing the function C=N+-O-, that are commonly used as probes for biological spin trapping applications. Nitroxide adducts >N-O• are formed by adding transient free radicals on the electrophilic carbon of nitrones and are detected by EPR due to their improved stability as compared to free radicals. Among the most commonly used nitrones, α-phenyl-N-tert-butylnitrone (PBN) and some analogues have demonstrated remarkable spin trapping ability and protective effects in several pathological conditions related to oxidative stress. As mitochondria is the primary biological source of endogenous production of ROS, a first derivative of PBN (mitoPBN) was synthesized some decades ago with a triphenylphosphonium (TPP) vector which is able to accumulate within the mitochondria matrix. However, due to its cytotoxicity at low doses the use of mitoPBN is not suitable at the concentrations required for spin trapping/EPR applications. In this context, we have synthesized in the first part of this work, a new series of β-phosphorylated nitrones (mitoPPNs) with different vectors (triethylammonium, pyridinium) to reach mitochondria and different carbon chain lengths in order to reduce cytotoxicity, modulate lipophilicity, improve biocompatibility and thus facilitate their safe use in biological environments. Using EPR, we have assessed their ability to scavenge biologically-relevant free radicals, centered on oxygen, carbon and to release nitric oxide in vitro. In a second part of this work, selected nitrones of the mitoPPNs series have been tested as tools for elucidating cellular mechanisms related to oxidative stress with the purpose to study the action of newly developed anticancer molecules. Since it was recently evidenced that ROS are involved in cancer development, the search in new therapies based on oxidative stress and redox regulation of mitochondrial function is booming. Therefore, in the present work a series of novel hybrid molecules has been developed to combine the antioxidant properties of polyphenols and the recently evidenced anticancer properties of metformin (a standard treatment for type II diabetes). The cytotoxicity of the new hybrids was studied in different types of cancer cell lines including glioblastoma cells. In a second step, their impact on relevant signaling pathways and their action on oxidative stress were evaluated. Finally, hybrids were studied for their ability to penetrate the blood-brain barrier and the potential interest of two compounds of the series was revealed.