Soutenance de thèse de SUBRAMANI NARAYANA Chandrasekar
Titre de thèse
Comptage et cinétique de liaison des bactériophages par apprentissage profond à partir d'images de microscopie en fluorescence
Deep learning-based counting and binding kinetics of bacteriophages imaged by fluorescence microscopy
Résumé de la thèse
L'utilisation de la microscopie à fluorescence pour faciliter la découverte d'anticorps par les méthodes de phage display ouvre des perspectives intéressantes dans le domaine de la biotechnologie. Cependant la quantification précise des événements de liaison antigène–anticorps médiés par des bactériophages, dans des conditions de densité variable, de bruit optique et d'hétérogénéité biologiqueprésente des défis importants en analyse d'image. Cette thèse présente un cadre d'analyse d'image informé par la physique, reposant sur l'apprentissage profond, pour compter les particules de bactériophages et en déduire les constantes cinétiques de liaison à partir de points temporels expérimentaux obtenus par des acquisitions en microscopie TIRF. Le système expérimental met en jeu des phages M13 exprimant des anticorps monoclonaux monodomaines (Nef19 et C28), marqués avec DyLight 488 ou Rhodamine, se liant à des surfaces recouvertes d'antigènes (Nef et CD16).
Les méthodes classiques d'analyse d'image ont d'abord été évaluées, révélant des limites dans les régimes de densité variable et dans la quantification indirecte de la densité via l'intensité. Une architecture U-Net personnalisée a ensuite été développée pour prédire à la fois les comptages globaux et les cartes de densité à partir de représentations 2D, 2.5D et 3D. Des données d'entraînement synthétiques générées à partir d'un modèle cinétique ont permis d'améliorer la généralisation dans les cas à haute densité. Le modèle a été affiné grâce à une adaptation de domaine et un ajustement sur des données annotées réelles.
Les densités de phages prédites ont été validées à l'aide des statistiques de Poisson et de la modélisation cinétique. Les densités quantifiées ont été ajustées à des courbes de liaison de Langmuir afin d'extraire les constantes d'association et de dissociation des systèmes antigène–anticorps étudiés. Ce travail établit un pipeline robuste et évolutif, combinant biophysique expérimentale et analyse d'image fondée sur l'intelligence artificielle, pour quantifier les interactions de liaison à une résolution moléculaire.
Thesis resume
Harnessing fluorescence microscopy to support antibody discovery by phage display methods opens interesting perspectives in biotechnology. However, the accurate quantification of phage-based antigen-antibody binding events under varying density, noisy, and heterogeneous conditions presents important image analysis challenges. This thesis presents a physics-informed image analysis framework with deep learning to count bacteriophage particles and infer binding kinetics from experimental time points via TIRF microscopy stacks. The experimental system involves M13 phages displaying monoclonal monodomain antibodies (Nef19 and C28) and labelled with DyLight 488 or Rhodamine, binding to antigen-coated (Nef and CD16) surfaces.
Classical image analysis methods were first assessed, revealing limitations in varying density regimes and intensity-based proxy density quantification. A customised U-Net architecture was then developed to predict phage global counts and density maps from 2D, 2.5D, and 3D image representations. Synthetic training data generated via a kinetic model improved generalisation in high-density cases. The model was further refined using domain adaptation and fine-tuning on annotated real data.
Predicted phage densities were validated using Poisson statistics and kinetic modelling. The quantified densities were fitted to Langmuir binding curves to extract association and dissociation rates of the phage-based antigen–antibody systems. This work establishes a robust, scalable pipeline that combines experimental biophysics with AI-based image analysis to quantify binding interactions with molecular resolution.