Soutenance de thèse de Saadat HUSSAIN

La régulation précise de l'expression des gènes au cours du développement normal et de la différenciation cellulaire sous-tend l'action d'éléments de régulation cis ayant des fonctions d'activation ou de répression. L'activation de gènes par les activités combinées de promoters et d'amplificateurs distaux a été largement étudiée dans des contextes normaux et pathologiques. En revanche, la répression des gènes par des elements represseurs à action cis, définis comme des éléments génétiques régulant négativement la transcription des gènes de manière indépendante de la position, est moins bien comprise. Malgré la croyance largement répandue que les elements represseurs représentent probablement des régulateurs généraux importants et critiques de l'expression des gènes, leur distribution à l'échelle du génome, leurs mécanismes d'action et leur implication dans la transformation oncogénique sont en grande partie inconnus. Nous reconsidérons ici CapSTARR-seq en tant que nouvelle stratégie à haut débit pour évaluer quantitativement l'activité des elements represseurs chez les mammifères. Cette approche associe la capture des régions d’intérêt à la technique STARR-seq précédemment développée. Nous avons effectué CapSTARR-seq en triple exemplaire avec trois vecteurs promoters différents dans des cellules p5424 pour déterminer si les éléments capturés présentaient les caractéristiques attendues des elements represseurs. La quantification de l'activité du silencers a été calculée en calculant le changement de pli entre le signal CapSTARR-seq et la bibliothèque d'entrée après filtrage des régions mal capturées. Les silencer putatifs ont présenté un enrichissement significatif pour le répresseur transcriptionnel REST. Nous avons validé une sélection de candidats potentiels au elements represseurs par dosage de la luciférase à double rapporteur. En conséquence, vingt-deux candidats testés sur vingt-huit ont présenté une activité de elements represseurs importante. En outre, treize silencers ont montré une activité de elements represseurs dans les deux orientations. Nos résultats suggèrent une stratégie générale pour l'identification et la caractérisation des elements represseurs à l'échelle du génome. En utilisant CRISPR / cas9, nous avons également validé un candidat elements represseurs.

The precise regulation of gene expression during normal development and cell differentiation underpins the action of cis-regulatory elements with either activation or repression functions. Gene activation by the combined activities of promoters and distal enhancers has been extensively studied in normal and pathological contexts. In sharp contrast, gene repression by cis-acting silencers, defined as genetic elements that negatively regulate gene transcription in a position independent fashion, is less well understood. Despite the widely-held belief that silencers likely represent important and critical general regulators of gene expression, their genome-wide distribution, mechanisms of action and involvement in oncogenic transformation are largely unknown. Here we repurpose the CapSTARR-seq as a novel high-throughput strategy to quantitatively assess silencers activity in mammals. This approach couples capture of regions of interest to previously developed STARR-seq technique. We performed CapSTARR-seq in triplicate with three different promoter vectors in p5424 cells to determine if the captured elements exhibited characteristics expected of silencers. Quantification of silencer activity was computed by calculating the fold change between the CapSTARR-seq signal and the input library after filtering of poorly captured regions. Putative silencers displayed a significant enrichment for the transcriptional repressor REST. We validated a selection of potential silencer candidates by dual reporter luciferase assay. As a result, twenty-two out of twenty-eight tested candidates displayed significant silencer activity. Furthermore, thirteen silencers showed silencer activity in both orientations. Our results suggest a general strategy for genome-wide identification and characterization of silencer elements. Using CRISPR/cas9 we also validated one silencer candidate.