Soutenance de thèse de DUPUIS Lucas

Résumé de la thèse

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négative, pathogène opportuniste, étudiée pour ses nombreux mécanismes de pathogénie ainsi que ses capacités d'adaptation. Lors de l'infection, et notamment dans le phagolysosome des macrophages, P. aeruginosa s'adapte à divers stress environnementaux, tels que la carence en nutriments et en métaux, le stress oxydatif, la baisse du pH, mais également le stress cuivre qui est utilisé comme agent anti-bactérien par le système immunitaire. Parmi ses mécanismes de pathogénie, P. aeruginosa compte des systèmes de sécrétion et d'export de protéines. Il a ainsi été montré que le système d'export Tat était essentiel à sa virulence, et à des mécanismes associés à la pathogénie comme la formation de biofilms, la motilité ou encore la résistance au cuivre. Pour mieux comprendre le rôle du système Tat à un niveau moléculaire, notre équipe de recherche étudie la fonction de chaque substrat Tat-dépendant et décrypte les liens entre ces substrats et les mécanismes de pathogénie. Une étude antérieure a permis l'identification de 34 protéines substrats du système Tat chez P. aeruginosa. L'objectif de ce travail a été d'élucider le rôle du système Tat et de ses substrats dans la résistance et l'adaptation au cuivre chez P. aeruginosa.
D'abord, une analyse ciblée de chacun des 34 substrats du système Tat a mis en évidence que deux d'entre eux, les protéines PcoA et Mco1, étaient prédits comme étant des multicopper oxidases (MCO). Les MCO sont des oxydases à cuivre, capables notamment de détoxifier le cuivre en l'oxydant de sa forme Cu+ à sa forme moins toxique Cu2+. Dans un premier temps nous avons confirmé que ces deux protéines avaient toutes les caractéristiques structurales et fonctionnelles des MCOs, et nous avons caractérisé leur activité oxydase in vitro avec différentes substrats. In vivo, l'induction de la production de Mco1 permet à P. aeruginosa une meilleure résistance au cuivre mais les conditions d'expression du gène mco1 restent, à ce jour, indéterminées. Nous avons pu confirmer en revanche que le gène pcoA était régulé par le cuivre via un système à deux composants CopRS. Nous avons également pu montrer que la protéine PcoA était essentielle à la résistance au cuivre, et que son rôle protecteur dépend d'une protéine prédite pour être localisée dans la membrane externe, PcoB. Ces résultats ont donc permis d'établir que le système Tat permettait l'export de multicopper oxidases, qui contribuent à la résistance au stress cuivre.
En parallèle, une seconde approche s'est basée sur le criblage d'une banque de mutants dans laquelle chacun des 34 gènes codant un des substrats Tat a été délété individuellement. La résistance au cuivre de chacune des souches a été comparée à la résistance d'une souche sauvage. Il est apparu qu'un ensemble de gènes pvd, impliqués dans la biosynthèse et la sécrétion de la pyoverdine, était essentiel à la résistance au cuivre. La pyoverdine est un sidérophore, capable de récupérer du fer extracellulaire avec une haute affinité en conditions de carence. Nous avons établi une corrélation claire entre la capacité des souches à produire de la pyoverdine et leur résistance au cuivre. Il apparaît donc que le système Tat joue un rôle dans la résistance au cuivre via l'export de protéines nécessaires à la production et à la sécrétion de la pyoverdine. Nous avons aussi cherché à comprendre comment ce sidérophore contribue à la résistance au cuivre.
Dans l'ensemble, ces résultats démontrent l'importance du système Tat dans la résistance au cuivre au travers de deux mécanismes distincts. Le premier mécanisme repose sur la détoxification du cuivre par l'activité de multicopper oxidases Tat-dépendantes et périplasmiques. En parallèle, ce système permet également l'export de protéines essentielles à la production et à la sécrétion de la pyoverdine, un sidérophore qui, une fois sécrété dans le milieu extracellulaire, protège P. aeruginosa contre le cuivre.