Soutenance de thèse de Esther Marie STEIDL

Les budgets de R&D pour la mise au point de nouveaux médicaments augmentent continuellement depuis 25 ans, mais le nombre de nouveaux médicaments mis sur le marché chaque année est loin d’être proportionnel aux investissements réalisés et reste faible. Une des raisons majeures de l’envolée des coûts de R&D est la faible proportion de composés en développement qui franchissent avec succès les phases de recherches cliniques. La deuxième cause d’échec au cours des phases cliniques est l’apparition d’effets secondaires indésirables. Parmi ces effets indésirables, l’apparition d’effets proconvulsivants est l’un des plus redoutés car il débouche la plupart du temps sur l’arrêt du programme de recherche, surtout si cet effet est découvert de façon tardive au cours du développement. Des tests existent pour détecter le potentiel proconvulsivant de médicaments en développement, cependant aucun d’entre eux ne fait consensus. Les tests in vitro basés sur l’injection de pentylènetétrazole ou d’électrochocs induisant des crises épileptiques engendrent des souffrances animales substantielles. Les tests comportementaux (test d’Irwin ou batterie d’observations fonctionnelles) sont peu prédictifs d’effets adverses liés au système nerveux central. De plus, tous ces tests in vivo sont souvent réalisés de façon tardive au cours du développement de médicaments. Les tests in vitro utilisant des cultures cellulaires ou de profilage pharmacologique par tests de liaison peuvent être réalisés de façon bien plus précoce, mais leur valeur prédictive peut être limitée du fait que ces modèles sont assez éloignés de la physiologie. L’objectif des travaux de recherche présentés ici était la mise au point d’une plateforme de tests pour identifier le potentiel proconvulsivant de composés de façon précoce au cours de leur développement. Ces tests ont été réalisés in vitro à partir de tranches d’hippocampes enregistrées à l’aide de multi-electrode arrays (MEA). La technique du MEA est particulièrement adaptée pour ce type d’investigations car elle permet d’évaluer l’effet de composés sur une large partie d’un réseau neuronal natif, incluant différents types cellulaires (neurones principaux, interneurones, glie, …). De plus, cette technique permet de réaliser des tests à moyen débit et à partir de faibles quantités de composé, ce qui est compatible avec les contraintes associées aux phases précoces de développement. Tout d’abord, l’évaluation de composés de référence a permis de déterminer les paramètres d’intérêt, qui sont modifiés par des composés proconvulsivants. Les composés proconvulsivants testés ont causé une augmentation de l’aire des potentiels d’action de population et l’apparition de potentiels d’action additionnels, déclenché des décharges épileptiformes et/ou augmenté la fréquence de décharge des neurones de la région CA1. Les conditions expérimentales des tests réalisés ont ensuite été modifiées pour augmenter leur sensibilité et permettre la détection de proconvulsivants faibles. Pour cela, les composés ont été évalués sur un réseau neuronal dont l’excitabilité était augmentée, notamment par la présence d’une faible concentration d’un proconvulsivant de référence. Cette plateforme de 3 tests complémentaires a été nommée NS-PC set. Pour valider la plateforme NS-PC set, 15 composés fournis par des sociétés pharmaceutiques partenaires, incluant des contrôles positifs et négatifs, ont été testés à l’aveugle. La majorité des composés proconvulsivants ont été détectés, mais les résultats n’étaient pas exempts de faux positifs et de faux négatifs. Un nouveau type de test plus rapide et abordable appelé NS-PC screen a ensuite été mis au point, sur la base d’enregistrement de décharges épileptiformes induites par la 4-aminopyridine dans des tranches d’hippocampe. Bien que ce test ne fournisse pas autant d’informations que le NS-PC set, les 13 composés de référence testés (incluant des contrôles positifs et négatifs) ont été identifiés correctement.

Research and development (R&D) budgets for drug development continuously increase for 25 years, but the number of new chemical entities getting a marketing approval is far from growing proportionally. One major reason for the soaring of R&D cost is the low proportion of compounds that successfully passes the clinical phases. The second cause of failure along clinical phases is the occurrence of adverse drug reaction. Among adverse drug reaction, proconvulsive effect is one of the most dreaded, as it often results in the termination of the project, especially if it is discovered late in the development phases. Some assays already exist to evaluate the proconvulsive potential of compounds, however, none of them makes consensus and all display different limitations. In vivo assays such as maximal electroshock seizure or pentylenetetrazole test involve substantial animal suffering, behavioral observations (Irwin test or functional observation battery) are poorly predictive of central nervous system adverse drug reactions, and all these in vivo assays could only be performed late in the development phases. In vitro assays based on cultured cells or pharmacological profiling of compound owing to binding assays could be performed much earlier, but the gap with physiological conditions could question about the predictability of the results. The goal of the present work was to develop a platform of tests that could predict the proconvulsive potential of compounds in development as early as possible during preclinical phases. These tests were carried out in vitro from hippocampal slices recorded with multi-electrode arrays (MEAs). The MEA technology is particularly adapted because it allows to investigate compounds’ effect on a wide area of a native neural network, including all the complexity and organization of the different cell types (main neurons, interneurons, glia ...). In addition, rapidity and low compound consumption of the MEA-based assays make them suitable for early stages of development. First, the evaluation of reference proconvulsive/seizurogenic compounds allowed to determine the parameters that should be monitored to detect proconvulsive properties. It appeared that reference compounds triggered one or several of the following effects: increase of the population spikes area and repetition of spikes, triggering of epileptiform discharges and/or increase of the CA1 neurons firing. The experimental conditions of the assays were then modified to increase their sensitivity and thus detect even weak proconvulsive compounds. For this, compounds were evaluated on a network of which excitability has been increased or in the presence of a low dose of proconvulsive compound. This platform of 3 complementary assays was termed NS-PC set. 15 compounds, including positive and negative controls, were provided by partner pharmaceutical companies to be tested under blind conditions on NS-PC set. The effect of most of the compounds was detected, but results were not exempt of false positives and false negatives. A new faster and cheaper assay, termed NS-PC screen, was designed based on the recording of 4-aminopyridine-induced epileptiform discharges in hippocampal slices. Although it does not provide as much information as NS-PC set, each of the 13 reference compounds tested (including positive and negative controls) were appropriately detected.