Soutenance de thèse de Audrey JACQ

Pour s’adapter aux fluctuations quotidiennes de leur environnement, les organismes ont développé un système d’horloge interne qui oscille sur une période d'environ 24h. Ce système, dit circadien, repose sur une expression rythmique de gènes. Les paraspeckles sont des corps nucléaires présents dans presque toutes les cellules des mammifères et qui peuvent retenir dans le noyau des ARNs de manière circadienne, entrainant une expression rythmique des protéines correspondantes. Ces paraspeckles sont formés du long ARN non codant (lncRNA), Neat1, auquel s’associent plusieurs protéines de liaison aux ARNs. Pour connaitre l’ensemble des ARNm dont la rythmicité d’expression est modulée par les paraspeckles, nous avons invalidé un de leurs constituant essentiel, le lncRNA Neat1, dans une lignée de cellules hypophysaires (GH4C1) via la technologie CRISPR-Cas9. Les ARN des cellules contrôles Neat1+/+ et Neat1-/- ont été récoltés après synchronisation toutes les 4h pendant 24h et envoyés en séquençage à haut débit. Cela nous a permis d’évaluer que parmi les ~4500 ARNm rythmiques dans les GH4C1, 15% présentent des différences circadiennes entre les deux génotypes cellulaires. Parmi ces ARNm, 30% sont des ARNm cibles connus des paraspeckles dans les GH4C1, suggérant que l’expression rythmique de ces ARNm est contrôlée au niveau post-transcriptionnel directement par les paraspeckles. La manière dont les ARNm sont liés aux paraspeckles est largement inconnue. Pour identifier un élément de recrutement des ARN par les paraspeckles, nous avons analyser les propriétés de l’ARNm de la Calréticuline (Calr) à s’associer aux paraspeckles. Nous avons montré que l'association de l'ARNm de Calr avec les paraspeckles implique une séquence de 15 nucléotides. Ce motif est retrouvé dans près de 30% de des ARN cibles des paraspeckles. De plus, nous avons démontré que ce motif est reconnu par la protéine des paraspeckles HNRNPK, ce qui suggère que HNRNPK puisse lier les ARNm via ce motif et ainsi induire la rétention nucléaire de ces ARNm. En plus de HNRNPK, il est également possible que le lncRNA Neat1 soit lui aussi directement impliqué dans la liaison des ARN et par conséquent dans leur rétention dans les paraspeckles. Pour tester cette hypothèse, nous avons adapté une technique de « RNA pull-down » qui permet d’isoler les partenaires moléculaires d'un lncRNA, en traitant les cellules GH4C1 avec un agent qui ne fixent que les interactions ARN-ARN. En couplant cette approche à du séquençage haut débit, nous avons établi la liste des ARNs associés directement à Neat1 et qui représentent plus de 30% du total des cibles paraspeckle identifiées précédemment. Nous avons aussi montré que les cibles ARN de Neat1 se lient de préférence à l'extrémité 5' de Neat1, correspondant à la région périphérique des paraspeckles. En conclusion, l’ensemble des travaux réalisés nous a permis de montrer que les paraspeckles, en retenant les ARNm dans le noyau de manière circadienne, modulent l’expression circadienne de milliers de gènes dans les cellules hypophysaires GH4C1. Et que cette liaison des ARNm aux paraspeckles peut se faire tant par la liaison directe au lncRNA Neat1 que par la liaison à la protéine HNRNPK reconnaissant un motif de 15 nucléotides présent dans les ARN.

To adapt to the daily fluctuations of their environment, organisms have developed an internal clock system that oscillates over a period of about 24h. This system, known as circadian, is based on the rhythmic expression of genes. Paraspeckles are nuclear bodies present in almost all mammalian cells and can retain RNAs in the nucleus in a circadian manner, resulting in a rhythmic expression of the corresponding proteins. Paraspeckles are formed of the long non-coding RNA (lncRNA) Neat1 and several RNA-binding proteins. In order to identify mRNAs whose rhythmic expression is modulated by the paraspeckles, we have invalidated one of their essential components, the lncRNA Neat1, in a pituitary cell line (GH4C1) using the CRISPR-Cas9 technology. RNAs from the Neat1+/+ control and Neat1-/- cells were harvested after synchronization every 4h for 24h and sent to high throughput sequencing. This allowed to evaluate that among the ~4500 rhythmic mRNAs in GH4C1, 15% showed circadian differences between the two cells genotypes. Among these mRNAs, 30% are known mRNAs target of the paraspeckles in GH4C1, suggesting that the rhythmic expression of these mRNAs is controlled at the post-transcriptional level directly by the paraspeckles. How the mRNAs are bound to the paraspeckles is largely unknown. To identify an element permitting the RNA recruitment by paraspeckles, we have analyzed the properties of Calreticulin (Calr) mRNA to associate with paraspeckles. We showed that the association of Calr mRNA with paraspeckles involves a sequence of 15 nucleotides. This pattern is found in nearly 30% of the target RNAs of the paraspeckles. In addition, we have shown that this pattern is recognized by the paraspeckle protein HNRNPK, suggesting that HNRNPK can bind mRNAs via this pattern and thus induce nuclear retention of these mRNAs. In addition to HNRNPK, it is also possible that the lncRNA Neat1 was also directly involved in the binding of RNAs. To test this hypothesis, we adapted an « RNA pull-down » technique to isolate the molecular partners of a lncRNA, by treating GH4C1 cells with an agent that fix only RNA-RNA interactions. By coupling this approach to high-throughput sequencing, we have established the list of RNAs directly associated with Neat1 and which represent more than 30% of the total paraspeckle targets previously identified. We also showed that the RNA targets preferentially interact with the 5' end of Neat1, corresponding to the peripheral region of the paraspeckles. In conclusion, this work shows that paraspeckles, by retaining mRNAs in the nucleus in a circadian manner, modulate the circadian expression of thousands of genes in GH4C1 pituitary cells. And that this binding of mRNAs to the paraspeckles can occur both by direct binding to the Neat1 lncRNA and by binding to the HNRNPK protein recognizing a 15-nucleotide motif present in the mRNAs.