Soutenance de thèse de SEMMAR Rayan
Titre de thèse
Approches innovantes en culturomique pour enrichir le répertoire du microbiote intestinal humain
Innovative culturomics approaches to enrich the repertoire of the human gut microbiota
Résumé de la thèse
Le microbiote humain reste largement méconnu malgré les recherches conduites ces 20 dernières années. Cela se reflète dans les données de métagénomique dont une partie non négligeable correspond à la « matière noire » microbienne, composée de nombreuses séquences non assignées représentant la diversité inconnue ainsi que des espèces incultivées, identifiées à partir de reconstructions métagénomiques. Les approches de culture sont ainsi les mieux indiquées pour explorer et décrire cette diversité inconnue. C'est dans ce contexte que s'inscrit mon travail de thèse, avec, dans un premier temps, une revue de la littérature sur l'évolution des outils taxonomiques et des techniques de description de nouvelles espèces. Nous listons les principaux changements taxonomiques et nous mettons à jour le répertoire des bactéries isolées chez l'Homme avec l'ajout de 479 nouvelles espèces, portant le répertoire total à 3730 espèces dont 657 découvertes à l'IHU Méditerranée Infection. L'évolution de ces outils, couplée à l'essor des méthodes de description rapide à haut débit, a déjà permis de décrire plus d'une centaine de nouvelles espèces bactériennes par protologue. Dans ce contexte, nous avons ensuite optimisé un workflow d'identification et de classification taxonomique à haut débit en y intégrant Protologger, nous permettant ainsi de décrire 55 nouvelles espèces bactériennes issues de prélèvements cliniques et de confirmer par ailleurs l'obsolescence du seuil de similarité à 98,65 % de l'ARN ribosomal (ARNr) 16S pour délimiter les espèces bactériennes. Dans le cadre de l'optimisation de la culturomique, nous évaluons par la suite l'impact d'adjuvants de culture alternatifs et démontrons que le jus de selles et la mucine sont plus fertiles et moins délicats à obtenir que le liquide ruminal, alors considéré jusqu'ici comme le gold standard. Enfin, nous avons mis au point une alternative au flacon d'hémoculture en développant une chambre de diffusion expérimentale permettant une diffusion passive continue de nutriments dans le milieu de culture. Ces techniques d'optimisation nous ont permis de découvrir 13 nouvelles espèces dont un nouvel ordre bactérien appartenant à la classe des Coriobacteriia et au phylum Actinomycetota ainsi que neuf nouveaux genres. Mon travail confirme la large part de diversité inconnue puisque six des nouvelles espèces représentaient le premier isolement d'espèces métagénomiques, issues de la matière noire microbienne. Cette thèse ouvre ainsi la voie à des études de culturomique à plus grande échelle utilisant les stratégies de culture évaluées de façon préliminaire couplées à la description à haut débit de nouvelles espèces grâce au workflow que nous avons optimisé. Ce travail souligne la nécessité de continuer à développer de nouvelles stratégies de culture pour capturer la diversité du microbiote humain, et de simplifier la description de nouveaux taxons bactériens pour qu'ils soient mis à disposition de la communauté scientifique.
Thesis resume
The human microbiome remains largely unknown despite research conducted over the past 20 years. This is reflected in metagenomic data, a significant proportion of which corresponds to microbial "dark matter," composed of numerous unassigned sequences representing unknown diversity, as well as uncultivated species identified from metagenomic reconstructions. Culture-based approaches are therefore the most suitable for exploring and describing this unknown diversity. It is in this context that my thesis work is situated, beginning with a literature review on the evolution of taxonomic tools and species description techniques. We list the main taxonomic changes and update the repertoire of bacteria isolated from Humans with the addition of 479 new species, bringing the total repertoire to 3,730 species, including 657 discovered at IHU Méditerranée Infection. The evolution of these tools, together with the rise of rapid, high-throughput description methods, has already enabled the description of more than a hundred new bacterial species through the protologue approach. In this context, we then optimized an identification worklow during this thesis, allowing us to describe 55 new species from clinical microbiology and to further confirm the obsolescence of the 98.65% similarity threshold of the 16S ribosomal RNA (rRNA) for delineating bacterial species. As part of the optimization of culturomics, we subsequently evaluated the impact of alternative culture adjuvants and demonstrated that fecal filtrate and mucin are more fertile and less cumbersome to obtain than rumen fluid, previously considered the gold standard. Finally, we developed an alternative to the blood culture bottle by designing an experimental diffusion chamber enabling continuous passive diffusion of nutrients into the culture medium. These optimization techniques allowed us to discover 13 new species, including a new bacterial order belonging to the class Coriobacteriia and the phylum Actinomycetota, as well as nine new genera. My work confirms the significant proportion of unknown diversity, as six of the new species represented the first cultured isolates of species previously known only through metagenomics, originating from the microbial dark matter. This thesis thus paves the way for larger-scale culturomics studies using the culture strategies preliminarily evaluated, coupled with the high-throughput description of new species through the workflow we optimized. This work highlights the need to continue developing new culture strategies to capture the diversity of the human microbiome, and to simplify the description of new bacterial taxa so that they can be made available to the scientific community.