Soutenance de thèse de SAWDEKAR Harshita
Titre de thèse
Les multiples voies du désordre aux fibrilles: Déterminants codés par la séquence de l'assemblage des protéines des Henipavirus
The Many Paths from Disorder to Fibrils: Sequence-Encoded Determinants of Henipavirus Protein Assembly
Résumé de la thèse
Les virus Nipah (NiV) et Hendra (HeV) sont des agents pathogènes humains sévères appartenant au genre Henipavirus dans la famille des Paramyxoviridae. Leurs protéines P, V et W sont des protéines multifonctionnelles impliquées dans la réplication virale (P) et la modulation de la réponse antivirale de l'hôte (V et W). Elles partagent un domaine N-terminal (NTD) qui est intrinsèquement désordonnée. Les études précédentes ont montré que le NTD, et en particulier deux de ses fragments (à savoir PNT1 et PNT3), présentent une propension intrinsèque à former des fibrilles de type amyloïde. Le caractère intrinsèquement désordonné de ces régions et leur propension à l'agrégation constituent un modèle pertinent pour étudier l'influence de la séquence, de la dynamique conformationnelle et des interactions moléculaires sur l'auto-assemblage protéique. Au cours de ma thèse, j'ai étudié les déterminants moléculaires de l'agrégation et de la fibrillation des sous-domaines PNT1 et PNT3 des Henipavirus. Dans ce but, j'ai d'abord purifié les protéines d'intérêt produites de manière recombinante chez E. coli, puis j'ai combiné plusieurs approches biophysiques, notamment l'analyze de dispersion de Taylor, le dichroïsme circulaire dans l'UV lointain, la microscopie électronique en transmission après coloration négative (ns-TEM), la spectroscopie de fluorescence de la Thioflavine T et la spectroscopie Raman.
Dans un premier temps, j'ai montré que les sous-domaines PNT1 et PNT3 du HeV ont des comportements d'agrégation distincts dans des conditions natives identiques. J'ai également montré que les petites molécules curcumine et EGCG réorientent l'agrégation vers des populations d'agrégats structuralement distincts sans supprimer la fibrillation. De plus, j'ai mis en évidence les limites des approches fondées sur la fluorescence lors de l'étude de composés intrinsèquement fluorescents.
J'ai ensuite montré que les sous-domaines PNT1 de sept membres appartenant au genre Henipavirus, bien qu'ils possèdent une région amyloïdogène cryptique (CAR) conservée, présentent des voies d'agrégation et des architectures fibrillaires fortement divergentes. En combinant des simulations de dynamique moléculaire, l'analyze par dispersion de Taylor et la spectroscopie Raman, j'ai démontré que le contexte de séquence, notamment les régions intrinsèquement désordonnées qui flanquent la CAR, module l'échantillonnage conformationnel, les premières étapes de l'agrégation et l'organisation structurale des assemblages matures. Pour finir, j'ai caractérisé l'ensemble conformationnel monomérique de NiV PNT1 par des approches de FRET en molécule unique et de simulation de dynamique moléculaire, révélant une hétérogénéité conformationnelle dépendante de la force ionique, comprenant des états étendus, intermédiaires et compacts, et montrant qu'une compaction globale peut coexister avec une dynamique locale et intramoléculaire importante.
Dans son ensemble, cette thèse montre que l'agrégation des protéines intrinsèquement désordonnées des Henipavirus n'est pas uniquement déterminée par la présence du désordre et d'un motif amyloïdogène conservé, mais résulte de l'interaction entre le contexte de séquence, l'hétérogénéité conformationnelle, les interactions intermoléculaires et les conditions environnementales. Ces résultats soutiennent un modèle dans lequel une grammaire moléculaire encodée par la séquence façonne l'ensemble conformationnel, oriente les voies d'agrégation et détermine finalement l'architecture des fibrilles. Ce travail apporte ainsi de nouvelles connaissances sur l'auto-assemblage dépendant du désordre intrinsèque des protéines virales et établit un cadre permettant d'étudier les conséquences biologiques potentielles de la diversité de leurs comportements d'agrégation.
Thesis resume
Nipah (NiV) and Hendra (HeV) viruses are highly pathogenic members of the Henipavirus genus within the Paramyxoviridae family. Their P, V, and W proteins are multifunctional proteins involved in viral replication (P) and modulation of the host antiviral response (V and W). They share a common N-terminal domain (NTD) that is intrinsically disordered. Previous studies showed that the NTD, and in particular two fragments thereof (i.e., PNT1 and PNT3), have an intrinsic propensity to form amyloid-like fibrils. The disordered nature and intrinsic aggregation propensity of these regions provide a unique framework to investigate how sequence, conformational dynamics, and molecular interactions govern protein self-assembly.
During my thesis, I investigated the molecular determinants underlying the aggregation and fibrillation of Henipavirus PNT1 and PNT3 subdomains. To this end, I first purified the proteins of interest recombinantly produced in E. coli and then combined multiple biophysical approaches, and in particular, Taylor dispersion analysis, far-UV circular dichroism, negative staining transmission electron microscopy (ns-TEM), thioflavin T fluorescence spectroscopy, and Raman spectroscopy.
I first unveiled that HeV PNT1 and PNT3 have distinct aggregation behaviors under identical native conditions and showed that the small molecules curcumin and EGCG redirect the aggregation pathway towards structurally distinct aggregate populations rather than suppressing fibrillation. In addition, I highlighted the limitations of fluorescence-based approaches when studying intrinsically fluorescent compounds.
I subsequently established that PNT1 subdomains from seven Henipavirus members, despite sharing a conserved cryptic amyloidogenic region (CAR), exhibit markedly divergent aggregation pathways and fibril architectures. By combining molecular dynamics simulations, Taylor dispersion analysis, and Raman spectroscopy, I showed that sequence context, particularly the intrinsically disordered regions flanking the CAR, modulates conformational sampling, early oligomerization, and the structural organization of mature assemblies.
Finally, I further investigated the monomeric conformational ensemble of NiV PNT1 using single-molecule FRET and molecular dynamics simulations, revealing salt-dependent conformational heterogeneity comprising extended, intermediate, and collapsed states and demonstrating that global compaction can coexist with substantial local and intramolecular dynamics.
Collectively, this thesis establishes that the aggregation of intrinsically disordered Henipavirus proteins is not dictated solely by the presence of disorder and of a conserved amyloidogenic motif but emerges from the interplay between sequence context, conformational heterogeneity, intermolecular interactions, and environmental conditions. These findings support a model in which sequence-encoded molecular grammar shapes the conformational ensemble, selects distinct aggregation pathways, and ultimately determines fibril architecture. This work provides new insights into disorder-driven self-assembly in viral proteins and establishes a framework for investigating the potential biological consequences of their diverse aggregation behaviors.