Ecole Doctorale
SCIENCES CHIMIQUES - Marseille
Spécialité
Sciences Chimiques
Etablissement
Aix-Marseille Université
Mots Clés
Galactolipides,Spectroscopie FTIR,Spectroscopie NMR,Lipolyse,Galactolipase,Chromatographie sur couche mince (CCM)
Keywords
Galactolipids,FTIR spectroscopy,NMR spectroscopy,Lipolyse,Galactolipase,Thin layer chromatography (TLC)
Titre de thèse
Etude de l'hydrolyse enzymatique des galactolipides par diverses approches chromatographique et spectroscopiques
Study of galactolipid enzymatic hydrolysis by various chromatographic and spectroscopic techniques
Date
Mercredi 16 Décembre 2020
Adresse
Campus Joseph Aiguier
31 Chemin Joseph Aiguier, 13009 Marseille .......
Jury
Directeur de these |
M. Frédéric CARRIERE |
Aix Marseille Université |
Examinateur |
Mme Nathalie DUPUY |
Aix Marseille Université |
Rapporteur |
M. Eric MARéCHAL |
Université Grenoble Alpes |
Rapporteur |
Mme Véronique VIé |
Université de Rennes 1 |
Examinateur |
Mme Yonghua LI-BEISSON |
Aix Marseille Université |
Examinateur |
M. Pierre VILLENEUVE |
Université Montpellier |
Résumé de la thèse
Les galactolipides sont les principaux constituants des membranes formant les thylacoïdes des chloroplastes des plantes, des algues et des cyanobactéries. Les galactolipides sont considérés comme la plus grande réserve dacide gras sur la planète. La lipase pancréatique apparentée de type 2 (PLRP2) est une enzyme permettant à de nombres mammifères de digérer les galactolipides et daccéder à cette importante source dacide gras. Cette thèse a contribué au développement de diverses méthodes danalyse pour létude de lhydrolyse des galactolipides, en particulier le monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), par la PLRP2 du cobaye (GPLRP2).
Dans un premier temps, nous avons étudié lhydrolyse dun galactolipide synthétique à chaines acyles moyennes, le MGDG (C8:0), par la GPLRP2 en utilisant un outil classique de la lipidomique, la chromatographie sur couche mince (CCM) couplée à la densitométrie. Le choix du réactif au thymol et à lacide sulfurique comme révélateur nous a permis de quantifier simultanément tous les composés galactosylés dans le milieu réactionnel. Les courbes cinétiques de la disparition de MGDG et de la production de monogalactosylmonoacylglycerol (MGMG) et de monogalactosylglycerol (MGG) ont pu ainsi être établies. Le désavantage de cette méthode est quelle nécessite de stopper la réaction, dextraire et de transformer les composés à quantifier, autant détapes qui augmentent lerreur dans la quantification mais aussi le risque de lévolution des composés avant leur révélation.
Dans un second temps, la même réaction a été étudiée mais avec des outils moins fréquents en lipidomique, des outils permettant de suivre lhydrolyse en temps réel sans extraction ni transformation des composés à analyser. Le premier outil utilisé a été la spectroscopie infrarouge (IR), nécessitant de réaliser la réaction dans le D2O. Lenregistrement successif du spectre IR du mélange réactionnel au cours du temps a permis dobserver des changements importants dans les vibrations du carbonyl, du carboxylate et du méthylène. Ces changements ont été attribués à la consommation de MGDG et à la production de MGMG et dacide octanoïque. Létalonnage de labsorption du MGDG, du MGMG et de lacide octanoïque dans la région des vibrations précédemment citées a ensuite permis de quantifier ces composés à partir du spectre du mélange réactionnel. Par la spectroscopie infrarouge et par la CCM, la même activité spécifique de la GPLRP2 et les mêmes courbes cinétiques de disparition du substrat et dapparition des produits ont été obtenues en étudiant la réaction dans le D2O.
Enfin, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton a été utilisée pour analyser la même réaction dans le D2O. Contrairement à la CCM et à la spectroscopie IR, qui nont pas pu quantifier directement lacide octanoïque et le MGG respectivement, la RMN a permis de quantifier à la fois le MGDG, le MGMG, le MGG et lacide octanoïque grâce à lintégration des pics de résonnance de certains protons identifiés. Outre lobtention de la même cinétique quavec les deux premières méthodes avec des données plus complètes, la RMN a permis aussi de caractériser les structures supramoléculaires dans lesquelles se trouvent les différents composés par lestimation de leurs diamètres hydrodynamiques en utilisant la RMN DOSY (Diffusion Ordered SpectroscopY).
Thesis resume
Galactolipids are the main components of thylakoid membranes in the chloroplasts of plants, algae and cyanobacteria. Galactolipids are considered as the most abundant source of fatty acid on the planet. The pancreatic lipase-related protein 2 (PLRP2) is an enzyme allowing some mammals to digest this important source of fatty acids. The present thesis contributed to the development of analytical methods for the study of galactolipids hydrolysis, in particular monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), by guinea pig PLRP2 (GPLRP2).
First, we studied the hydrolysis of a synthetic medium acyl chains galactolipid, MGDG (C8:0), by GPLRP2 using a classical lipidomics tool, the thin layer chromatography (TLC) coupled with densitometry. We selected the thymol and sulfuric acid reagent as revealing agent, this allowed us to simultaneously quantify all galactosylated compounds in the reaction medium. Kinetics curves for MGDG consumption and monogalactosylmonoacylglycerol (MGMG) and monogalactosylglycerol (MGG) production were thus established. The disadvantage of this method is the need to stop the reaction, to extract and derivate the compounds to quantify, many steps that increase error in quantification and also the risk of evolution of the compounds before their revelation.
Second, the same reaction was studied with less common tools in lipidomics, which allow to monitor the hydrolysis in real time without extraction or derivatization of the compounds. The first tool used was the infrared (IR) spectroscopy, requiring to perform the reaction in D2O. By recording series of reaction mixture spectra over time, we observed significant changes in the vibrations of carbonyl, carboxylate and methylene. These changes were attributed to the consumption of MGDG and the production of MGMG and octanoic acid. Calibration of MGDG, MGMG and octanoic acid absorption in the region of vibrations mentioned above allowed the quantification of these compounds from the reaction mixture spectra. The same specific activity of GPLRP2 and kinetic curves were obtained by studying the reaction in D2O by infrared spectroscopy and TLC.
Proton nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy was then used to analyze the same reaction in D2O. Unlike TLC and IR spectroscopy, which could not directly quantify octanoic acid and MGG respectively, NMR allowed both MGDG, MGMG, MGG and octanoic acid to be quantified by integrating the resonance peaks of some identified protons. This method allowed not only to obtain the same kinetics than the first two methods with more complete data, but also to characterize supramolecular structures of the different compounds quantified by estimating their hydrodynamic diameters using DOSY (Diffusion Ordered SpectroscopY) NMR.