Ecole Doctorale

SCIENCES CHIMIQUES - Marseille

Spécialité

Sciences Chimiques

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

Galactolipides,Spectroscopie FTIR,Spectroscopie NMR,Lipolyse,Galactolipase,Chromatographie sur couche mince (CCM)

Keywords

Galactolipids,FTIR spectroscopy,NMR spectroscopy,Lipolyse,Galactolipase,Thin layer chromatography (TLC)

Titre de thèse

Etude de l'hydrolyse enzymatique des galactolipides par diverses approches chromatographique et spectroscopiques
Study of galactolipid enzymatic hydrolysis by various chromatographic and spectroscopic techniques

Date

Mercredi 16 Décembre 2020

Adresse

Campus Joseph Aiguier 31 Chemin Joseph Aiguier, 13009 Marseille .......

Jury

Directeur de these M. Frédéric CARRIERE Aix Marseille Université
Examinateur Mme Nathalie DUPUY Aix Marseille Université
Rapporteur M. Eric MARéCHAL Université Grenoble Alpes
Rapporteur Mme Véronique VIé Université de Rennes 1
Examinateur Mme Yonghua LI-BEISSON Aix Marseille Université
Examinateur M. Pierre VILLENEUVE Université Montpellier

Résumé de la thèse

Les galactolipides sont les principaux constituants des membranes formant les thylacoïdes des chloroplastes des plantes, des algues et des cyanobactéries. Les galactolipides sont considérés comme la plus grande réserve d’acide gras sur la planète. La lipase pancréatique apparentée de type 2 (PLRP2) est une enzyme permettant à de nombres mammifères de digérer les galactolipides et d’accéder à cette importante source d’acide gras. Cette thèse a contribué au développement de diverses méthodes d’analyse pour l’étude de l’hydrolyse des galactolipides, en particulier le monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), par la PLRP2 du cobaye (GPLRP2). Dans un premier temps, nous avons étudié l’hydrolyse d’un galactolipide synthétique à chaines acyles moyennes, le MGDG (C8:0), par la GPLRP2 en utilisant un outil classique de la lipidomique, la chromatographie sur couche mince (CCM) couplée à la densitométrie. Le choix du réactif au thymol et à l’acide sulfurique comme révélateur nous a permis de quantifier simultanément tous les composés galactosylés dans le milieu réactionnel. Les courbes cinétiques de la disparition de MGDG et de la production de monogalactosylmonoacylglycerol (MGMG) et de monogalactosylglycerol (MGG) ont pu ainsi être établies. Le désavantage de cette méthode est qu’elle nécessite de stopper la réaction, d’extraire et de transformer les composés à quantifier, autant d’étapes qui augmentent l’erreur dans la quantification mais aussi le risque de l’évolution des composés avant leur révélation. Dans un second temps, la même réaction a été étudiée mais avec des outils moins fréquents en lipidomique, des outils permettant de suivre l’hydrolyse en temps réel sans extraction ni transformation des composés à analyser. Le premier outil utilisé a été la spectroscopie infrarouge (IR), nécessitant de réaliser la réaction dans le D2O. L’enregistrement successif du spectre IR du mélange réactionnel au cours du temps a permis d’observer des changements importants dans les vibrations du carbonyl, du carboxylate et du méthylène. Ces changements ont été attribués à la consommation de MGDG et à la production de MGMG et d’acide octanoïque. L’étalonnage de l’absorption du MGDG, du MGMG et de l’acide octanoïque dans la région des vibrations précédemment citées a ensuite permis de quantifier ces composés à partir du spectre du mélange réactionnel. Par la spectroscopie infrarouge et par la CCM, la même activité spécifique de la GPLRP2 et les mêmes courbes cinétiques de disparition du substrat et d’apparition des produits ont été obtenues en étudiant la réaction dans le D2O. Enfin, la spectroscopie de résonance magnétique nucléaire (RMN) du proton a été utilisée pour analyser la même réaction dans le D2O. Contrairement à la CCM et à la spectroscopie IR, qui n’ont pas pu quantifier directement l’acide octanoïque et le MGG respectivement, la RMN a permis de quantifier à la fois le MGDG, le MGMG, le MGG et l’acide octanoïque grâce à l’intégration des pics de résonnance de certains protons identifiés. Outre l’obtention de la même cinétique qu’avec les deux premières méthodes avec des données plus complètes, la RMN a permis aussi de caractériser les structures supramoléculaires dans lesquelles se trouvent les différents composés par l’estimation de leurs diamètres hydrodynamiques en utilisant la RMN DOSY (Diffusion Ordered SpectroscopY).

Thesis resume

Galactolipids are the main components of thylakoid membranes in the chloroplasts of plants, algae and cyanobacteria. Galactolipids are considered as the most abundant source of fatty acid on the planet. The pancreatic lipase-related protein 2 (PLRP2) is an enzyme allowing some mammals to digest this important source of fatty acids. The present thesis contributed to the development of analytical methods for the study of galactolipids hydrolysis, in particular monogalactosyldiacylglycerol (MGDG), by guinea pig PLRP2 (GPLRP2). First, we studied the hydrolysis of a synthetic medium acyl chains galactolipid, MGDG (C8:0), by GPLRP2 using a classical lipidomics tool, the thin layer chromatography (TLC) coupled with densitometry. We selected the thymol and sulfuric acid reagent as revealing agent, this allowed us to simultaneously quantify all galactosylated compounds in the reaction medium. Kinetics curves for MGDG consumption and monogalactosylmonoacylglycerol (MGMG) and monogalactosylglycerol (MGG) production were thus established. The disadvantage of this method is the need to stop the reaction, to extract and derivate the compounds to quantify, many steps that increase error in quantification and also the risk of evolution of the compounds before their revelation. Second, the same reaction was studied with less common tools in lipidomics, which allow to monitor the hydrolysis in real time without extraction or derivatization of the compounds. The first tool used was the infrared (IR) spectroscopy, requiring to perform the reaction in D2O. By recording series of reaction mixture spectra over time, we observed significant changes in the vibrations of carbonyl, carboxylate and methylene. These changes were attributed to the consumption of MGDG and the production of MGMG and octanoic acid. Calibration of MGDG, MGMG and octanoic acid absorption in the region of vibrations mentioned above allowed the quantification of these compounds from the reaction mixture spectra. The same specific activity of GPLRP2 and kinetic curves were obtained by studying the reaction in D2O by infrared spectroscopy and TLC. Proton nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy was then used to analyze the same reaction in D2O. Unlike TLC and IR spectroscopy, which could not directly quantify octanoic acid and MGG respectively, NMR allowed both MGDG, MGMG, MGG and octanoic acid to be quantified by integrating the resonance peaks of some identified protons. This method allowed not only to obtain the same kinetics than the first two methods with more complete data, but also to characterize supramolecular structures of the different compounds quantified by estimating their hydrodynamic diameters using DOSY (Diffusion Ordered SpectroscopY) NMR.