Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Immunologie

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

lymphocyte T,AFM,forces mecaniques,,

Keywords

T cells,AFM,mechanical forces,,

Titre de thèse

Propriétés micromécaniques des lymphocytes T et leur signalisation
Micromechanical properties of T cells and their signalling

Date

Mercredi 5 Décembre 2018 à 14:00

Adresse

Faculté des sciences d'Aix-Marseille 163 Avenue de Luminy, 13288 Marseille amphi 12

Jury

Directeur de these M. Pierre-Henri PUECH Laboratoire d'Adhésion et Inflammation
Rapporteur Mme Claire HIVROZ Institut Curie
Rapporteur M. Loïc DUPRé Centre de Physiopathologie de Toulouse-Purpan
CoDirecteur de these M. Yannick HAMON Centre d'Immunologie de Marseille Luminy
Examinateur Mme Kheya SENGUPTA Centre Interdisciplinaire de Nanoscience de Marseille
Examinateur Mme Hélène DELANOE-AYARI Institut Lumière Matière

Résumé de la thèse

Mon projet porte sur l'étude des propriétés mécaniques des Lymphocytes T grâce à la microscopie à force atomique (AFM). Nous nous intéressons plus particulièrement à l'influence de la mécanique sur les événements précoces de l'activation T dans le cadre d'une réponse immunitaire adaptative par la reconnaissance d'un peptide antigénique [1]. Les événements biochimiques de l'activation T sont connus et décrits pour la plupart depuis longtemps, initiés par l’engagement du T Cell Receptor (TCR) par le Complexe Majeur d'Histocompatibilité (CMH), couplé à des peptides antigéniques. Cette reconnaissance constitue l’élément central de l'initiation de la réponse immunitaire adaptative, évènement à la fois extrêmement spécifique (discriminant parmi une très grande variété d’antigènes), sensible (virtuellement un seul antigène peut-être suffisant), et rapide (la réorganisation de la membrane d’un lymphocyte T débute à l’échelle de la seconde après l’engagement). Une question qui demeure sans réponse est de comprendre comment un lymphocyte T naïf peut traduire la diversité antigénique environnante en signal spécifique et maitrisé. Parmi les explications avancées récemment [2], le TCR agirait comme un mécano-senseur permettant au lymphocyte T d’appréhender la mécanique de son environnement à une échelle cellulaire [3]. Cependant, ces études ont été réalisées pour la plupart en opposant à un lymphocyte T un substrat inerte (par exemple bille ou surface décorée), limitant la relevance physiologique de tels travaux, ne permettant de recréer que de manière partielle et artificielle la complexité des interactions T/APC [4]. Nous nous sommes proposés dans ce projet de thèse d'utiliser l'AFM dans un mode force, technique nommée « Single Cell Force Spectroscopy » (SCFS). Cette approche permet avant tout de mesurer des forces d’interactions entre une cellule T (hybridome T 3A9 portant une TCR spécifique que l’antigène HEL) et une cellule APC (cellules COS7 transfectées avec les chaines αβ du CMHII I-Ak, chargée ou non avec des peptides antigéniques HEL). Ce système cellulaire certes expérimental permet d’induire les différentes étapes de la transduction du signal TCR dépendante, en particulier la réponse calcique. L 'APC est accrochée au cantilever de l'AFM et est présentée (selon une force et un temps de contact préétablis) au lymphocyte T immobilisé sur une surface et dont l'activation est suivie au cours du temps grâce à une sonde calcique fluorescente. Dans le souci de standardiser la forme des cellules T et de contrôler leurs propriétés mécaniques, nous avons déterminé par impression protéique en utilisant le « Micro-Contact Printing », quel pourrait être le meilleur substrat permettant l'adhésion et l’étalement des lymphocytes T sans provoquer ni activation calcique (quantifiée par MAAACS [6]) ni anergie. Nous avons ainsi objectivé que les molécules utilisées généralement dans la littérature pouvait induire soit une pré-activation du lymphocyte T, soit anergiser ces cellules. Nous proposons en conséquence une approche alternative en exprimant une molécule d’adhésion non relevante du système immunitaire, permettant l’adhésion, l’étalement de cellules T 3A9, tout en leur conservant leur immunocompétence. Ma thèse a porté sur la mise en place de toutes les étapes expérimentales du couplage de l'AFM avec la microscopie à fluorescence permettant la mise en contact d'une APC et d'un lymphocyte T sous force et en quantifiant la réponse calcique antigène dépendante au cours du temps. Références: 1. Malissen B, Bongrand P. Annu Rev Immunol. 2015; 33:539-61. 2. Kim S.T. et al. J Biol Chem. 2009; 284(45):31028-37. 3. Zhu C et al. Annu. Rev. Phys. Chem. 2015; 66:427-51. 4. Comrie WA et al. J Cell Biol. 2015 ; 208(4):457-73. 5. Cazaux S et al, Ultramicroscopy 2016; 160:168-81. 6. Salles A et al, Plos Comput Biol. 2013; 9(9):e1003245.

Thesis resume

We focus on the intriguing problem of the influence of mechanics on the first T cell activation steps in adaptive immune system self / non-self recognition [1]. At molecular level, this has been shown to begin with the binding of the T cell receptor (TCR) and a peptide loaded by the Major Histocompatibility Complex (pMHC) borne by an Antigen Presenting Cell (APC). Aside of its high sensitivity, and robustness, this recognition system possesses mechanotransductory features as demonstrated recently: TCR itself may acts an a mechanosensor [2] while the T cell can sense substrate mechanics at a more global cell scale [3]. However, these studies are usually made with a T cell facing an inert model substrate, hence limiting the understanding of the contribution of each cellular partner in the signaling, via force transduction, while the presence of the APC itself may induce strong effects on the T cell organisation. [4] We propose here to use Atomic Force Microscopy in Single Cell Force Spectroscopy mode (SCFS) to present a lego-like APC cell model, complexifiable at will, onto immobilized T cells , while recording simultaneous calcium flux in realtime [5]. In an attempt to standardize the experiments, such as controlling T cell adhesion area, position, shape and mechanical properties, we set to use micro-contact printing of carefully chosen molecules using MAAACS technique [6], able to make the T cell adhere strongly without triggering neither activation nor anergy. We observed nevertheless that the most efficient and commonly used strategies might induce indirect biais in patterned T cell activation. To overcome this, we designed and tested a novel and innovative molecular construction in the very same T cell model allowing firm immobilization but nearly zero unwanted effect on activation. We present here some preliminary recognition and activation data between APC and T cell, under controlled forces, using this system. My project was about all the experimental steps leading tocoupling fluorescence microscopy and AFM allowing the contact between an APC and a T cell under controlled force and monitoring overtime the antigen-dependent calcium response. References : 1. Malissen B, Bongrand P. Annu Rev Immunol. 2015; 33:539-61. 2. Kim S.T. et al. J Biol Chem. 2009; 284(45):31028-37. 3. Zhu C et al. Annu. Rev. Phys. Chem. 2015; 66:427-51. 4. Comrie WA et al. J Cell Biol. 2015 ; 208(4):457-73. 5. Cazaux S et al, Ultramicroscopy 2016; 160:168-81. 6. Salles A et al, Plos Comput Biol. 2013; 9(9):e1003245.