Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Maladies Infectieuses

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

co-culture,virus,bactéries intracellulaires strictes,haut débit,isolement,high content screening

Keywords

co-culture,viruses,strict intracellular bacteria,hight throughput,isolation,high content screening

Titre de thèse

Nouvelles stratégies et méthodes à haut débit pour l'isolement des virus et des bactéries intracellulaires strictes
New strategies and high-throughput methods for the isolation of viruses and strict intracellular bacteria

Date

Jeudi 2 Juillet 2020 à 11:00

Adresse

19-21 boulevard jean moulin, 13005, Marseille amphi

Jury

Directeur de these M. Bernard LA SCOLA Aix Marseille université
Examinateur M. Eric GHIGO Startup Technico-jouvence
Rapporteur M. Patrice MORAND Université de grenoble alpes
Rapporteur Mme Sylvie PILLET Université Saint-Etienne

Résumé de la thèse

Les bactéries intracellulaires strictes et les virus sont des microorganismes fastidieux dont certains sont des pathogènes humains. Leurs stratégies d’isolement sont basées sur la co-culture, surtout que les méthodes de culture axénique sont encore loin d’être optimales. Cette co-culture a été confrontée au développement de nouvelles techniques de diagnostic rapide, et a été abandonnée pendant longtemps, pour reprendre son statut important ces dernières années. Cependant, les méthodes actuelles restent fastidieuses et très peu d’améliorations ont été rapportées. Ceci constitue une difficulté pour les microbiologistes, limitant ainsi le nombre de souches isolées. De nombreux obstacles font face à l’isolement de ces microorganismes, notamment au niveau des conditions de co-culture, des stratégies de détection, parfois subjectives, et surtout la nécessité de laboratoires spécialisés et de l’expertise. De ces faits, l’optimisation des stratégies de culture aux besoins actuels furent nécessaires. Cet ouvrage cible la co-culture des bactéries intracellulaires strictes et la culture virale. Deux pilons se présentent : d’une part, l’optimisation et la standardisation des étapes de co-culture, et d’autre part, l’optimisation et l’automatisation des stratégies de détection qui y sont associées. Pour cela, nous avons revisité les techniques de co-culture afin de déterminer les facteurs critiques affectant cette dernière. De plus, nous avons eu recours à des outils innovants en imagerie du « high content screening » permettant l’acquisition d’images en temps réel et les analyses multiparamétriques de ces images à grande échelle à l’aide d’algorithmes spécifiques. Ces outils ont été appliqués pour une remise à niveau de stratégies efficaces d’isolement. La première partie était la mise au point en utilisant un système facile afin de valider notre principe. Pour cela, nous avons ciblé l’isolement des virus géants, co-cultivés sur des amibes, comme c’est une culture bien maîtrisée dans notre laboratoire. Nous avons réussi à développer une stratégie d’isolement à haut débit, en associant les étapes de co-culture miniaturisées à une détection basée sur des algorithmes spécifiques ciblant les amibes infectées. Cette stratégie était plus efficace que les techniques classiques pour isoler ces virus. Ce système automatisé nous a également permis d’augmenter le nombre d’échantillons analysés ainsi que le nombre d’isolats, et de faciliter les criblages à grande échelle. La seconde partie porte sur les potentielles applications en microbiologie clinique. Nous avons appliqué notre nouvelle stratégie pour l’isolement des bactéries intracellulaires strictes et des virus, notamment Coxiella burnetii et le SARS-CoV-2. Pour cela, des optimisations ont été rapportées sur le processus de la co-culture ciblant plusieurs niveaux. Ensuite, nous avons développé un système de détection permettant la reconnaissance des effets cytopathiques causés par C. burnetii à l’aide d’algorithmes spécifiques. Ce système a ensuite été appliqué pour des tests de sensibilité aux antibiotiques à grande échelle. Cette méthode qui a connu un succès dans le laboratoire de microbiologie pour l’isolement de C. burnetii, a été exploité pendant la pandémie du COVID-19, où là également, nous avons développé des algorithmes spécifiques à ce virus, ce qui nous a permis d’isoler un grand nombre de souches qui seront exploitées dans des analyses plus profondes ainsi que dans la recherche de traitement et de vaccins. Cette nouvelle approche d’automatisation des stratégies d’isolement nous a permis d’améliorer la co-culture, d’augmenter les taux d’isolement et d’éliminer les différentes contraintes telles que les risques de contaminations et les analyses subjectives dépendantes de l’opérateur. Nos résultats montrent que de telles stratégies robustes sont indispensables en microbiologie clinique, surtout en cas d’épidémies, et peuvent aussi être applicable à d’autres domaines de la recherche.

Thesis resume

Strict intracellular bacteria and viruses are tedious microorganisms, some of which are human pathogens. Their isolation strategies are based on co-culture, especially since axenic culture methods are still far from optimal. This co-culture has been confronted with the development of new rapid diagnostic techniques, and has been abandoned for a long time, to regain its important status in recent years. However, current co-culture methods remain tedious and very few improvements have been reported. This constitutes a major difficulty for microbiologists, thus limiting the number of isolated strains. Many obstacles are facing the isolation of these microorganisms, at the levels of co-culture conditions, detection strategies, sometimes subjective, and the need for specialized laboratories and expertise. Therefore, the optimization of these culture strategies to current needs was necessary. This book targets the co-culture of strict intracellular bacteria, as well as viral culture. Two pillars are presented herein: first, the optimization and standardization of co-culture, and second, the optimization and automation of the detection strategies associated with this co-culture. Subsequently, we have revisited the co-culture techniques in order to determine the critical factors affecting them. In addition, we introduced innovative high content screening tools for real-time image acquisition and multi-parameter analysis of these images at large scale using specific algorithms. These tools have been applied for an effective upgrade of the isolation strategies. The first part of this work was the development stage using an easy system to validate our principle. For this, we first targeted the isolation of giant viruses, co-cultured on amoebas, as it is a culture well mastered in our laboratory. We successfully developed a high-throughput isolation strategy, by combining miniaturized co-culture steps with real-time detection based on specific algorithms targeting infected amoebae. This strategy was more efficient than conventional techniques for the isolation of these viruses. This automated system also allowed us to increase the number of samples analyzed as well as the number of isolates, and to facilitate large scale screening. The second part represents potential applications in clinical microbiology. We applied our new strategy for the isolation of strict intracellular bacteria and viruses, notably C. burnetii and SARS-CoV-2. First, optimizations have been reported to the co-culture process targeting several levels. Then, we developed a specific detection system allowing the recognition of the cytopathic effects caused by C. burnetii using specific algorithms. This system was then applied for large-scale antibiotic susceptibility testing. This method, which was successful in the microbiology laboratory for the isolation of C. burnetii, was also used during the COVID-19 pandemic, where once again, we were able to develop algorithms specific to this virus, which allowed us to isolate a large number of strains that will be later used deeper analyzes as well as in research for treatment and vaccines. This new approach to automating isolation strategies allowed us to improve co-culture, increase isolation rates and eliminate various constraints such as the risks of contamination and the subjective operator-dependent analyzes. Our results show that such robust strategies are essential in clinical microbiology, especially during epidemics, and may also be applicable to other areas of research.