Ecole Doctorale

Sciences de la Vie et de la Santé

Spécialité

Biologie-Santé - Spécialité Microbiologie

Etablissement

Aix-Marseille Université

Mots Clés

Tat,Export,Virulence,Pseudomonas aeruginosa,Motilité de type Twitching,Pili de type 4

Keywords

Tat,Export,Virulence,Pseudomonas aeruginosa,Twitching Motility,Type 4 pili

Titre de thèse

rôle du système d'export tat de pseudomonas aeruginosa : identification des substrats et implication dans la motilité de type twitching
role of the tat export system in pseudomonas aeruginosa : identification of tat substrates and involvement in twitching motility

Date

Lundi 17 Décembre 2018 à 14:00

Adresse

Institut de Microbiologie de la Méditerranée 31, chemin Joseph Aiguier 13009 MARSEILLE Amphithéatre Pierre Desnuelle

Jury

Directeur de these Mme Sophie BLEVES Aix-Marseille Université
CoDirecteur de these Mme Bérengère IZE CNRS
Examinateur M. Eric CASCALES CNRS
Rapporteur M. Alain FILLOUX Imperial London College
Rapporteur Mme Tracy PALMER Newcastle university
Examinateur M. Eric FAUDRY CEA Grenoble Biosciences and Biotechnology Institute of Grenoble

Résumé de la thèse

Chez les bactéries, 30% des protéines sont transportées hors du cytoplasme où elles sont synthétisées. Pour prendre les protéines en charge dans le cytoplasme et les transporter au travers des membranes, de nombreuses machineries sont impliquées. Ces machineries sont des complexes protéiques enchâssés dans l’enveloppe bactérienne. L’objectif de ma thèse a été l’étude d’une machinerie de transport de protéines, le système d’export Tat du pathogène opportuniste P. aeruginosa. Cette machinerie est retrouvée dans de nombreux organismes vivants allant des plantes aux bactéries. Chez les bactéries, le système Tat agit en parallèle d’un autre système d’export, le système Sec pour permettre le passage de la membrane interne. Alors que le système Sec permet le transport de protéines dans une conformation entièrement dépliées, les protéines transportées par le système Tat sont entièrement repliées. Pour la reconnaissance à l’une ou à l’autre des deux machineries, les protéines sont synthétisées avec une séquence N-terminale spécifique à sa propre machinerie de transport, les séquences signal. Les séquences signal reconnues par la machinerie Tat possèdent des signatures caractéristiques dont un motif conservé R-R-x-F-L-K contenant les deux arginines ayant conféré son nom au système (« Twin arginine translocation system »). Pour connaître le rôle et l’importance du système Tat chez P. aeruginosa, il était indispensable de connaître le nombre et la nature des protéines transportées par cette machinerie. L’ensemble du génome de la souche PA14 a donc été criblé pour la présence des signatures conservées caractéristiques des séquences reconnues par la machinerie Tat. Cette approche in silico a permis la mise en évidence d’un ensemble de séquences signal putatives. Une confirmation expérimentale a ensuite systématiquement été effectuée pour chacune de ces séquences putatives. Pour cela un test rapporteur a été réalisé chez l’hôte hétérologue E. coli, le test amidase. La combinaison de l’approche in silico et de l’approche expérimentale a permis la mise en évidence de 26 nouvelles protéines transportées par la machinerie Tat en plus des 8 déjà caractérisées auparavant. En parallèle de l’identification des protéines Tat-dépendantes, un ensemble de phénotypes présenté par la souche PA14Dtat et en lien avec la virulence bactérienne ont pu être mis en évidence. Ainsi, un rôle a pu être attribué au système Tat dans la motilité bactérienne, dans la résistance au cuivre, dans la virulence… Nos résultats indiquent donc que la souche PA14Dtat présente un défaut de motilité de type twitching. Ce type de motilité consiste en un déplacement bactérien médié par des pili de type IV. Ces appendices extracellulaires sont dynamiques ; ils polymérisent, adhèrent par leur extrémité distale à un support et dépolymérisent permettant ainsi le rapprochement des bactéries au support et le déplacement bactérien. Nous avons fait l’hypothèse que si une souche PA14Dtat présente un défaut de motilité, ce défaut est causé par l’absence d’export d’au moins une protéine dépendante du système Tat. Afin d’identifier cette protéine parmi les 34 substrats Tat mis en évidence précédemment, j’ai construit une banque des mutants individuels dans l’ensemble des protéines transportées par la voie Tat. La motilité de type twitching a ensuite été testée sur les 34 mutants de délétion de la banque et comparé à celle de la souche PA14Dtat. De manière remarquable, cette approche nous a permis d’identifier une seule protéine responsable du défaut de twitching du mutant PA14Dtat. Par la suite, le défaut de motilité a pu être caractérisé chez ce nouveau mutant dans le but de comprendre le lien moléculaire existant entre le système Tat et les pili de type IV.

Thesis resume

In bacteria, 30% of the proteins are transported out of the cytoplasm where they are synthesized. To ensure efficient recognition and transport of cytoplasmic proteins numerous machineries are anchored in the bacterial envelop. My PhD work has been dedicated to a machinery devoted to the export of proteins through the inner membrane, the Tat pathway, in the opportunistic pathogen P. aeruginosa. This machinery is widely conserved a can be found in eukaryotic plants as well as in prokaryotic cells. In bacteria, the Tat pathway acts in parallel to another export system, the Sec pathway, to transport proteins form the cytoplasm to the periplasm through the inner membrane. While the Sec pathway allows the transport of unfolded proteins, the Tat pathway allows the transport of fully folded proteins. To be addressed to one of these machineries, proteins are synthetized with specific N-terminals signal sequences. Tat signal sequences possess specific characteristics such as the highly conserved motif R-R-x-F-L-K. The two consecutives arginine in this motif have given the name to the system (Twin arginine translocation system). To decipher the scope and role of the Tat pathway in P. aeruginosa, it was essential to appreciate the amount and the nature of the proteins transported by this machinery. In order to do so, the whole genome of the PA14 strain has been screened for the typical signatures of Tat signal sequences using prediction programs. This in silico analysis highlighted a number of putative Tat dependent signal sequences. These candidate signal sequences have then been systematically experimentally tested for their dependence to the Tat system using a reporter assay in the heterologous host E. coli, called the amidase assay. Altogether, the combination of in silico and experimental approaches allowed the discovery of 26 new Tat-dependent proteins. In addition to the 8 proteins already shown to be Tat-dependent before my work, there are now 34 proteins which have been experimentally shown to be transported by the Tat pathway in P. aeruginosa. In parallel to the identification of Tat-dependent substrates, a set of phenotypes linked to virulence has been uncovered for the PA14Dtat strain. Among them, we show that the PA14Dtat strain presents a defect in bacterial motility, an increased copper sensitivity, a decreased virulence… Our results clearly indicate that the PA14Dtat strain shows a defect in a motility called twitching. This type of motility is induced by extracellular appendages called type IV pili. These pili are highly dynamics; they exhibit cycle of polymerization, adhesion of the distal extremity to a surface and depolymerization. These successive cycles lead to bacterial movement. Next, we made the assumption that the PA14Dtat strain motility defect was caused by the mislocalization of one Tat dependent protein in this strain. To prove our hypothesis and identify the Tat substrate involved among the 34 Tat substrates discovered previously we constructed a bank of single deletion mutants in all the 34 identified Tat dependent proteins. Next, twitching motility was tested for all the deletion strains and compared to the motility of the PA14Dtat. Remarkably, a single mutant showed the same twitching defect than the PA14Dtat strain. Subsequently, the motility defect was characterized in this new mutant in order to understand the molecular link between the Tat system and type IV pili.