Soutenance de thèse de WEBER Lana
Titre de thèse
Etude structurale et fonctionnelle de GacS, une histidine kinase majeure contrôlant les modes d'infection de Pseudomonas aeruginosa
Structural and functional study of GacS, a major histidine kinase controlling the infection modes of Pseudomonas aeruginosa
Résumé de la thèse
Les systèmes à deux composants (TCS) constituent l'un des principaux outils dont disposent les bactéries pour s'adapter à un environnement en constante évolution. Composés d'une histidine kinase et d'un régulateur de réponse associé, ils permettent de détecter une grande variété de signaux environnementaux et déclencher des réponses cellulaires adaptées. Ces réponses régulent de nombreux aspects de la physiologie bactérienne, tels que la division cellulaire, la pathogénicité ou encore le métabolisme.
Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram négatif, pathogène opportuniste, capable de coloniser une grande diversité d'environnements et de provoquer à la fois des infections nosocomiales à l'échelle mondiale et des infections sévères chez les patients immunodéprimés. Elle se distingue par un nombre particulièrement élevé de TCS par rapport aux autres bactéries à Gram négatif, ce qui lui confère une remarquable capacité d'adaptation à ses habitats ainsi qu'une modulation fine de sa virulence en fonction de l'hôte infecté. Pseudomonas aeruginosa présente deux modes d'infections : une forme aiguë, où les bactéries sont planctoniques et disséminées dans le flux sanguin, et une forme chronique, caractérisée par la formation d'un biofilm résistant à de nombreux antibiotiques.
Le réseau multi-kinase Gac/rsm joue un rôle central dans la transition entre ces deux modes d'infections. Au cœur de ce réseau se trouve le TCS GacS/GacA. Après la reconnaissance d'un signal environnemental, l'histidine kinase GacS subit une trans-autophosphorylation suivie d'un phosphorelais en quatre étapes, qui aboutit à la phosphorylation et l'activation du régulateur de réponse GacA.
GacS est composée de plusieurs domaines impliqués dans ces différentes étapes d'autophosphorylation et de transfert du phosphate. Récemment, un nouveau domaine non caractérisé (domaine ND) a été identifié entre le domaine CA, responsable de la fixation de l'ATP, et le domaine receveur D1. Ce domaine s'est avéré essentiel à l'activité d'autophosphorylation de GacS, bien que sa fonction précise demeure inconnue.
Cette thèse porte sur l'étude de la fonction du domaine ND et son implication dans l'autophosphorylation de GacS, ainsi que sur la compréhension des mécanismes moléculaires permettant l'autophosphorylation. Une approche de mutagénèse dirigée sur le cœur catalytique de GacS a mis en évidence l'importance de l'interface entre les domaines CA et ND pour l'activité de la protéine. Elle a également révélé un rôle clé des cystéines présentes dans le domaine ND, suggérant un mécanisme d'auto-régulation de l'histidine kinase. Enfin, des approches complémentaires de cristallographie, SEC-SAXS et SDSL-RPE ont permis d'étudier la dynamique de GacS et de proposer un premier modèle structural d'une forme active de la protéine.
Thesis resume
Two-component systems (TCS) are among the main tools used by bacteria to adapt to constantly changing environments. Composed of a histidine kinase and a cognate response regulator, they allow bacteria to detect a wide variety of environmental signals and trigger appropriate cellular responses. These responses regulate numerous aspects of bacterial physiology, including cell division, pathogenicity, and metabolism.
Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative, opportunistic pathogen capable of colonizing a wide range of environments and causing both nosocomial infections worldwide and severe infections in immunocompromised patients. It stands out for its particularly high number of TCS compared to other Gram-negative bacteria, which provides it with a remarkable ability to adapt to its habitats and finely tune its virulence depending on the infected host. Pseudomonas aeruginosa exhibits two modes of infection: an acute form, in which the bacteria are planktonic and disseminated through the bloodstream, and a chronic form, characterized by the formation of a biofilm resistant to many antibiotics.
The Gac/rsm multi-kinase network plays a central role in the transition between these two infection modes. At the core of this network lies the GacS/GacA TCS. Upon recognition of an environmental signal, the histidine kinase GacS undergoes trans-autophosphorylation followed by a four-step phosphorelay, ultimately leading to the phosphorylation and activation of the response regulator GacA.
GacS is composed of several domains involved in these different autophosphorylation and phosphate transfer steps. Recently, an uncharacterized domain (ND domain) was identified between the CA domain, responsible for ATP binding, and the D1 receiver domain. This domain was found to be essential for GacS autophosphorylation activity, although its precise function remains unknown.
This thesis focuses on investigating the function of the ND domain and its role in GacS autophosphorylation, as well as on understanding the molecular mechanisms underlying this process. A site-directed mutagenesis approach on the catalytic core of GacS highlighted the importance of the interface between the CA and ND domains for protein activity. It also revealed a key role for cysteine residues within the ND domain, suggesting a self-regulatory mechanism of the histidine kinase. Finally, complementary approaches, including crystallography, SEC-SAXS, and SDSL-EPR, were used to study GacS dynamics and propose a first structural model of the active form of the protein.