Soutenance de thèse de SASKA Vita
Titre de thèse
Accroche spécifique des CueOs sur électrodes et rôle du domaine Met-rich sur la bioélectrocatalyse
Site-specific anchoring of CueOs on electrodes and the role of the Met-rich domain in bioelectrocatalysis
Résumé de la thèse
La famille des oxydases multicuivre (MCO) regroupe un grand nombre d'enzymes, dont les copper efflux oxydases (CueO). Ces enzymes se distinguent des autres MCOs par leur activité cuprous oxydase (oxydation des ions Cu⁺), qui détermine leur rôle physiologique proposé dans l'homéostasie du cuivre. Les CueOs se caractérisent par un domaine flexible riche en méthionines qui recouvre le site actif et pourrait déterminer l'activité enzymatique. L'hypothèse principale de cette thèse est que le contrôle de l'orientation de l'enzyme à la surface de l'électrode permettrait d'étudier la dynamique et les changements conformationnels du domaine riche en méthionines en fonction de divers facteurs externes.
Le premier objectif de cette thèse était donc de déterminer comment les enzymes CueO peuvent être ancrées par fixation en un point unique à une interface électrochimique. Pour ce faire, une cystéine a été introduite à la surface de l'enzyme pour se lier spécifiquement à des fonctions complémentaires présentes sur l'électrode. Deux réactions principales ont été évaluées, à savoir la réaction thiol-ène et la réaction cystéine-maleimide, et différentes stratégies ont été appliquées pour fonctionnaliser l'électrode. Il a été démontré que l'adsorption non spécifique de la protéine prévalait sur la fixation en un point unique. Une stratégie alternative a consisté à utiliser le domaine riche en méthionines pour ancrer spécifiquement la CueO sur l'électrode. Il a été montré que ce domaine, au lieu d'augmenter, diminuait la vitesse de transfert électronique interfacial par encombrement stérique autour du site CuT1.
Les paramètres autres que l'orientation pouvant influencer la bioélectrocatalyse ont ensuite été étudiés. Une attention particulière a été portée aux facteurs susceptibles d'activer ou d'inactiver la CueO, notamment l'activation par Cu²⁺ et l'inhibition par les halogénures. Un processus d'activation dépendant de Cu²⁺, distinct de l'activité cuprous oxydase, a été mis en évidence. Nous avons démontré que ce processus correspond à une métallation in situ de la protéine, assistée par électrochimie, un processus original qui pourrait être appliquée à d'autres MCO. Un rôle de protection contre l'inhibition par les chlorures par les domaines Met-rich a de plus été montré.
Enfin, nous avons étudié l'effet de la force ionique sur la bioélectrocatalyse, ce qui nous a conduit à proposer que la compaction de l'enzyme contrôle la vitesse de transfert électronique. D'autre part, cette étude nous a permis de conclure que l'adsorption non spécifique ne peut pas être empêchée simplement en augmentant la force ionique.
Thesis resume
The multicopper oxidase (MCO) group encompasses a large number of enzymes, including copper efflux oxidases (CueOs). These enzymes are distinguished from other MCOs by their cuprous oxidase activity (oxidation of Cu⁺ ions), which determines their proposed physiological role in copper homeostasis. A key contributor to this activity of CueOs is thought to be a flexible methionine-rich domain that covers the active site and which may modulate the enzyme activity. The main hypothesis of this thesis is that controlling the orientation of the enzyme on the electrode surface will allow the study of the dynamics and conformational changes of the Met-rich domain in relation to various external factors.
The first aim of this thesis was thus to determine how CueO enzymes can be anchored by one-point attachment at an electrochemical interface. To achieve this, the enzyme was engineered with cysteine for specific binding to complementary functions at the electrode. Two main reactions were evaluated namely thiol-ene and cysteine-maleimide, and different strategies were applied to functionalize the electrode. Non-specific adsorption of the protein was demonstrated to prevail over one-point attachment. An alternative strategy explored was the use of the Met-rich domain for specific anchorage of the CueO on gold electrode. However, it was shown that, instead of increasing, the Met-rich domain was decreasing the interfacial electron transfer rate by steric hindrance over the CuT1.
The parameters other than enzyme orientation that may affect the bioelectrocatalysis were further investigated. It was particularly emphasized the factors that can activate or inactivate CueO, including Cu2+-activation and halide inhibition. A Cu2+-dependent activation process distinct from the cuprous oxidase activity was highlighted. We demonstrated that this process is the in situ protein metalation assisted by electrochemistry, an original finding that could be applied to other MCOs. The role of the Met-rich domain was also demonstrated in protection of CueOs from chlorides inhibition. Finally, we investigated the effect of ionic strength on bioelectrocatalysis, which allowed us to propose that enzyme compaction controls the electron transfer rate. Furthermore, the results allowed us to conclude that non-specific adsorption will not be prevented merely by increasing the ionic strength.