Soutenance de thèse de ZUCHAN Kilian

Résumé de la thèse

L' hydrogénase à [FeFe], HydABC(D), représente un groupe de flavoenzymes catalysant la réaction de la bifurcation/confurcation des électrons qui a été découverte récemment. Le mécanisme de cette réaction, catalysé par la flavine, n'est pas encore compris.
HydABC(D) partage son architecture modulaire avec d'autres déshydrogénases à NAD(P)H telles que le complexe I de la chaîne respiratoire, les hydrogénases à [NiFe] et la formiate déshydrogénase. Toutes comportent deux modules protéiques distincts, ici appelés modules "jonction Y" et module à "flavine", qui assurent le transfert d'électrons entre le NAD(P)+/NAD(P)H et divers substrats bioénergétiques. Le module jonction Y héberge trois centres [4Fe-4S] et un centre [2Fe-2S] disposés en forme de Y. Le module à flavine comporte un seul FMN, avec deux clusters FeS voisins, un cluster [2Fe-2S] de type thiorédoxine et un cluster [4Fe-4S], disposés en triangle. Notre analyse phylogénétique de ce module à flavine a conduit à un regroupement de ces enzymes en deux groupes distincts qui sont caractérisés par des signatures de séquences spécifiques qui corrèlent avec leur capacité à coupler la réduction/oxydation de la ferrédoxine à celle du NAD(P)+/NAD(P)H. La présence requise des deux substrats, démontrée expérimentalement pour HydABC ainsi que pour les autres membres de la famille de ces déhydrogénases à NADPH dépendant de la présence la ferrédoxine, définit le mécanisme de la bifurcation ou de la confurcation des électrons au niveau de la flavine (FBEB/FBEC). Elle va de pair avec la présence de certains domaines mobiles à centres FeS du sous-complexe HydBC. Les paramètres physico-chimiques de l'ensemble des cofacteurs de ce groupe d'enzymes n'ont pas encore été caractérisés.
Dans ce travail, les caractéristiques spectrales et les potentiels rédox de 9 des 10 cofacteurs de l'apo-HydABC de Thermotoga maritima, produite de façon hétérologue chez Escherichia coli, ainsi que de ses sous-unités isolées, ont été déterminés. La flavine de HydB montre, à des valeurs de pH inférieures à 7, un potentiel rédox de -160 mV pour la première transition électronique (EOX/SR). Un pKa,ox de 7 peut être attribué à la protonation de l'azote N(5) des cycles isoalloxazine de la FMN. La deuxième transition électronique (ESR/RED) ayant lieu en dessous de -500 mV, indiquant un état semi-réduit neutre de la flavine est fortement stabilisé avec un log(Ks) d'environ 6,8. Ces propriétés rédox du FMN dans la sous-unité isolée HydB pourraient correspondre à l'état de ce cofacteur dans le complex entier, dans lequel le domaine adjacent à HydB, c'est-à-dire la partie de HydC mobile portant le cluster [2Fe-2S] de type thiorédoxine est dans une position loin de HydB. Dans l'apo-HydABC, des propriétés rédox différentes ont été déterminées pour la flavine avec les deux transitions rédox individuelles beaucoup plus rapprochées l'une de l'autre et autour de -120 mV, ce qui est bien plus élevé que celles des centres FeS voisins autour -400 mV.
Dans aucun des échantillons étudiés, HydB ou apo-HydABC, les propriétés rédox de la flavine et des clusters FeS environnants ne satisfont aux exigences d'une réaction de confurcation des électrons comme celle décrite pour le site Qo des complexes Rieske/cytb, avec les potentiels rédox de la flavine présentant une forte coopérativité positive et le potentiel rédox global à deux électrons (EOX/RED) de la flavine situé entre les potentiels rédox des deux donneurs d'électrons.
Cependant, les caractéristiques spectrales des cofacteurs rédox dans HydABC reflètent celles d'autres membres de la famille des NAD(P)H-déshydrogénases, en particulier en ce qui concerne les clusters FeS proches de la flavine. Ceci fournit la base pour les investigations expérimentales d'autres membres de la famille, en mettant l'accent sur les propriétés thermodynamiques de la flavine et des cofacteurs adjacents, pour élucider les capacités catalytiques du FMN et ses implications dans la FBEB/FBEC.