Soutenance de thèse de MORAGUES Adrien
Titre de thèse
Synthèse et développement de sondes fluorescentes pour la détection des carbonyles induits par le stress oxydant
Synthesis and Development of Fluorescent Probes for the Detection of Carbonyls Induced by Oxidative Stress
Résumé de la thèse
Les composés carbonylés, tels que les aldéhydes et les cétones, sont omniprésents dans
l'environnement et jouent un rôle important en contexte biologique, notamment dans les
situations de stress oxydatif. Ce dernier, défini comme un déséquilibre entre espèces
oxydantes et systèmes antioxydants, conduit à l'accumulation d'espèces carbonylées
réactives (RCS), capables de modifier de façon irréversible des biomolécules essentielles
(protéines, lipides, ADN). La détection et la quantification de ces composés constituent un enjeu majeur pour la compréhension des mécanismes physiopathologiques associés au stress oxydant. Cette thèse s'inscrit dans le développement de méthodes analytiques
sensibles, sélectives et reproductibles, adaptées à la détection des carbonyles en milieu
biologique. Deux approches distinctes mais complémentaires ont été menées en parallèle. La première, de nature quantitative, s'est intéressée à l'élaboration des sondes
fluorescentes dérivées du 4-hydrazino-7-nitrobenzofurazan (NBDH), un motif reconnu
pour ses propriétés photophysiques, mais encore peu exploité dans ce contexte. Un dérivé propargylique a notamment montré une émission intense en présence du méthylglyoxal, un dicarbonyle endogène hautement réactif impliqué dans plusieurs pathologies. Pour explorer plus largement cette réactivité, plusieurs analogues ont été synthétisés, en faisant varier la substitution sur la fonction hydrazine. Leurs performances analytiques ont été évaluées en termes de sensibilité, de sélectivité et de stabilité, avec l'appui de calculs théoriques pour interpréter les comportements observés.
En parallèle, un second projet a été développé dans l'objectif de localiser, de manière
fine, les sites d'oxydation des protéines. Il ne s'agissait plus ici de mesurer les protéines
carbonylées en solution, mais de concevoir une sonde greffable, permettant une détection via enrichissement et analyse protéomique. Les sondes conçues intègrent trois fonctions clés : une hydrazine pour la réactivité vis-à-vis des carbonyles, une fonction alcyne pour l'immobilisation sur résine via une réaction "click", et un groupe azo clivable facilitant la libération des fragments d'intérêt. La voie de synthèse a été construite pour intégrer ces trois éléments, et plusieurs étapes critiques ont été optimisées, notamment la formation du lien azo et les conditions de clivage.
Ces deux approches se sont croisées de manière pertinente autour de la fonction
alcyne. Introduite initialement pour la stratégie de localisation, elle a également été testée sur des sondes fluorescentes. Il a ainsi été montré qu'elle se révélait particulièrement utile pour la chimie "click" sur des sondes adaptées, en revanche, son introduction sur le noyau fluorescent était moins pertinente par rapport à d'autres substituants plus efficaces. Cette complémentarité des approches ouvre des perspectives intéressantes pour la détection ciblée et la cartographie des altérations carbonylées en milieu biologique
Thesis resume
Carbonyl compounds, such as aldehydes and ketones, are ubiquitous in the
environment and play a significant role in biological systems, particularly under oxidative
stress conditions. Oxidative stress, defined as an imbalance between oxidant species and
antioxidant defenses, leads to the accumulation of reactive carbonyl species (RCS) capable
of irreversibly modifying essential biomolecules such as proteins, lipids, and DNA. The
detection and quantification of these compounds represent a major challenge for
understanding the pathophysiological mechanisms associated with oxidative stress. This
thesis focuses on the development of sensitive, selective, and reproducible analytical
methods suitable for the detection of carbonyls in biological environments.
Two distinct yet complementary approaches were undertaken in parallel.
The first of a quantitative nature, focused on the development of fluorescent probes
derived from 4-hydrazino-7-nitrobenzofurazan (NBDH), a scaffold known for its
photophysical properties but still underutilized in this context. A propargylic derivative
showed intense emission in the presence of methylglyoxal, a highly reactive endogenous
dicarbonyl implicated in several pathologies. To further explore this reactivity, various
analogues were synthesized by modifying the hydrazine substituent. Their analytical
performance was evaluated in terms of sensitivity, selectivity, and stability, supported by
theoretical calculations to interpret the observed behaviours.
In parallel, a second project aimed to precisely localize sites of protein oxidation. This
strategy did not focus on measuring carbonylated proteins in solution, but rather on
designing a graftable probe for detection via enrichment and proteomic analysis. The
probes were designed to incorporate three key functionalities: a hydrazine moiety for
reactivity toward carbonyl groups, an alkyne handle for resin immobilization through
"click" chemistry, and a cleavable azo linker to facilitate the release of target fragments.
The synthetic route was developed to integrate these elements, and several critical steps
were optimized, notably azo bond formation and cleavage conditions.
These two approaches converged notably around the alkyne functionality. Initially
introduced for protein localization strategies, the alkyne was also tested in the fluorescent
probe context. It was found to be particularly valuable for click chemistry with suitable
probes; however, its incorporation into the fluorescent core was less effective compared
to other, more efficient substituents. This complementarity between approaches opens
promising avenues for targeted detection and mapping of carbonyl modifications in
biological systems.