Soutenance de thèse de May KHODER

Les Neisseria forment un genre de bactéries à Gram négatif en diplocoques appartenant à la classe des bêta-proteobacteria. Certains espèces sont des commensaux des épithéliums muqueux humains, tandis que deux espèces N.meningitidis et N.gonorrhoeae sont des pathogènes pouvant induire une inflammation. L'identification de routine est basée sur des tests biochimiques, et plus récemment, de nouveaux outils avancés y compris le MALDI-TOF et la caractérisation génétique.Des études récentes ont montré que des problèmes d’infertilité humaine sont à l’infection par N.gonorrhoeae. Peu de données sont disponibles sur l’identification des espèces commensales de Neisseria et son corrélation avec l’infertilité. Pour ces raisons, il nous est apparu intéressant de monter un travail de thèse qui s’entoure autour de quatre axes principaux, 1- l’épidémiologie, la recherche clinique et la résistance aux ATB, 2- la taxonomie du genre Neisseria, 3- l’analyse et la comparaison génomique et 4- la caractérisation moléculaire de la résistance aux céphalosporines chez N.flavescens. Nous nous sommes intéressés au premier temps à évaluer plusieurs outils d’identification conventionnels et moléculaires afin de déterminer la prévalence, identifier les espèces et évaluer la resistance aux antibiotiques des souches de Neisseria isolées à partir d’échantillons de sperme provenant des hommes Libanais souffert ou non de stérilité. Cette étude nous a permis de mettre en évidence pour la première fois que le risque d'infection par des souches commensales de Neisseria était 2 fois plus élevé chez les patients présentant une stérilité par rapport au groupe témoin. De même, nos résultats ont montré que la technique d’API NH ainsi que le séquençage d’ARNr 16S ne permettent pas d’identifier Neisseria au niveau de l’espèce, alors que le MALDI-TOF et le séquençage du gène rplF semblent être le diagnostic le plus fiable. Dans un second temps, nous avons voulu étudier la taxonomie du genre Neisseria en se basant sur les analyses génomiques et plus précisément celle du génome complet. La taxonomie est sujette à de nombreux changements selon les données et les méthodes utilisés, et suit l’évolution des techniques d’identification des bactéries. Pour ce faire, tous les génomes complets ou non des espèces de Neisseria disponibles sur NCBI ont été téléchargés et comparés avec ceux provenant de quatre souches de Neisseria Libanaises analysées par un séquençage de génome complet. Nos résultats ont rapporté des problèmes taxonomiques dans les bases de données ce qui nécessite quelques modifications dans la nomenclature, en plus, nous avons alors redéfinit la notion d’espèce à l’aide de ces analyses génomiques au niveau du genre Neisseria. Le troisième axe avait pour but d’analyser le génome complet d’une souche de N.meningitidis isolée à partir du sperme d'un homme stérile. Une étude plus approfondie basée sur des analyses de séquençage du génome entier a été réalisée pour savoir les facteurs de virulence tels que les gènes de la biosynthèse de la capsule, le transporteur ABC et les protéines d’adhésion de surface ainsi que savoir les gènes spécifiques du N.gonorrhoeae qui sont responsables de la maladie. Enfin, le dernier axe a visé l’étude du génome d’une souche de N.flavescens résistante aux céphalosporines de la troisième génération. Pour ce faire, on a analysé le génome entier de cette souche et on a cherché les facteurs de virulence et de résistance par l’outil d’Arg-annot. Ceci nous a permis de déterminer la présence d’un gène mosaïque penA présentant plusieurs mutations rapportées pour la première fois chez N.flavescens. En conclusion, l’ensemble de ces données obtenues montre que les Neisseria commensales ont un impact important sur la santé humaine et sont probablement associées avec l'infertilité chez l’Homme. En plus, le genre Neisseria contient beaucoup des erreurs au niveau du génome et nécessite une réorganisation de la taxonomie de nouveau.

Neisseria spp. are Gram-negative diplococci bacteria belonging to the class of beta-proteobacteria. Some species are commensals of human mucosal epithelia, while two species are pathogens, Neisseria meningitidis and Neisseria gonorrhoeae, which can induce inflammation and break mucosal barriers. Although Neisseria spp. are very similar genetically, they differ in their adaptation to different niches and the presentation of the disease. Routine identification is mainly based on biochemical tests, however recently new advanced tools including MALDI-TOF and genetic characterization have been used to identify this bacterial genus. Simultaneously, the causes of infertility in men are less known than those responsible for female infertility. Recent studies have confirmed that human infertility problems are caused by N. gonorrhoeae infection. Unfortunately, few data are available concerning the identification of commensal Neisseria species and their correlation with infertility.For these reasons, it seemed interesting to carry out a thesis project articulated around four different axes: i) Epidemiology, clinical research and antibiotic resistance, ii) Taxonomy of the genus Neisseria, iii) Comparative genomic analysis and iv) Molecular characterization of cephalosporin resistance in Neisseria flavescens.We focused initially to evaluate several microbiological identification methods to determine prevalence, identify species and evaluate antibiotic susceptibility profiles of Neisseria strains isolated from semen samples of Lebanese men. For the first time, we reported a high risk of Neisseria semen infection in infertile patients in comparison with the control group.Furthermore, our findings showed that API NH and 16S rRNA sequencing are poor tools to identify Neisseria at the species level. Therefore, a reliable diagnosis of cases using MALDI-TOF and/or rplF sequencing is important to critically provide treatment decisions and prevent the antibiotic resistance spread within the community.Secondly, we studied the taxonomy of the genus Neisseria based on genomic analyzes and more precisely that of the complete genome. The taxonomy is subject to many changes based on the data and methods used, and follows the evolution of bacterial identification techniques. To do this, all the complete or draft Neisseria species genomes available on NCBI were downloaded (i.e. N. gonorrhoeae, N. meningitidis, N. flavescens, N. perflava, N. mucosa, and N. macacae) and compared with four strain draft genomes of our collection obtained by whole genome sequencing. Our results reported some taxonomic problems in the databases which need some modifications in the nomenclature. We then redefined the notion of species using these genomic analyzes at the Neisseria genus level.The third topic aimed to analyze the complete genome of a N. meningitidis strain isolated from semen samples of a Lebanese man. Furthermore, a whole genome sequencing analyses identified that the strain belongs to ST-23, and harbors several virulence factors such as capsule biosynthesis genes, transporter ABC, surface adhesion proteins and specific genes of N. gonorrhoeae (CRISPR system, membrane proteins and enzymes).Finally, the last axis focused on the genome study of a strain of N. flavescens resistant to third generation cephalosporins. To do this, we analyzed the entire genome of this isolate and we looked for the virulence and resistance factors by Arg-annot. The reported data suggest the presence of a mosaic penA gene with several mutations reported for the first time in N. flavescens.In conclusion, our findings showed that commensal Neisseria species have a significant impact on human health, and are probably associated with infertility in men. On the other hand, the available genomic data regarding Neisseria on NCBI database contains many errors and requires a reclassification of predicted species in order to correct the taxonomy of this genus.