Soutenance de thèse de BIDONDO Lucía
Titre de thèse
Étude des thioredoxines et de leurs cibles chez Neurospora crassa : rôle dans la saprotrophie et l'adaptation à l'hypoxie
Study of Thioredoxins and Their Targets in Neurospora crassa: role in saprotrophy and Hypoxic Adaptation
Résumé de la thèse
Le système thioredoxine (Trx) est un composant fondamental de la machinerie cellulaire, qui maintient l'homéostasie redox dans tous les domaines du vivant. Chez les levures, les thioredoxines (Trx), les thioredoxine réductases (TRR) et le NADPH modifient l'état rédox des résidus cystéine de protéines cibles en facilitant les réactions d'échange thiol-disulfure. Ces modifications post-traductionnelles régulent la fonction des protéines cibles, les voies de signalisation et la réponse au stress,. Le champignon saprophyte Neurospora crassa, organisme modèle pour l'étude de la biologie fongique, constitue un excellent modèle pour explorer le rôle de la régulation redox dans l'adaptation métabolique chez les champignons filamenteux, notamment lors de la dégradation de parois cellulaires végétales. Cependant, le système Trx de N. crassa, ses cibles protéiques et son rôle dans la régulation des mécanismes de dégradation de parois végétales restent peu explorés.
Dans cette thèse, nous avons identifié par analyse bioinformatique trois Trx et une TRR composant le système Trx de N. crassa. Comparé au système Trx bien caractérisé de Saccharomyces cerevisiae, N. crassa présente des caractéristiques uniques, telles qu'une extension C-terminale dans TRX-1, conservée chez deux classes d'ascomycètes. De façon surprenante, nous n'avons pas identifié de TRR mitochondriale, soulevant des questions sur les mécanismes de recyclage de la Trx mitochondriale. En utilisant la chromatographie d'affinité avec des isoformes monocystéiniques de chacune des trois Trx et des extraits protéiques de champignon cultivé en condition d'induction de la production de cellulases, nous avons identifié l'ensemble des protéines interagissant potentiellement avec Trx. Parmi elles, des kinases, des facteurs de transcription, des synthases de chitine, ainsi que des protéines liées au stress oxydatif et à la régulation des cellulases présentaient un fort facteur d'enrichissement pendant la chromatographie. Notamment, des facteurs de transcription comme CLR-1 et des kinases telles que OS-1, composant de la voie OS-2 MAPK, ont été identifiés. Les modèles structuraux et des essais biochimiques sur CLR-1 ont révélé des cystéines impliquées dans la formation de ponts disulfure intermoléculaires et de multimères sensibles aux ROS .
Nous avons également étudié la réponse fongique à l'anoxie durant la dégradation de la cellulose, et révélé des modifications significatives dans la production d'enzymes de dégradation des parois végétales et des parois fongiques, indicateurs d'une réponse adaptative du métabolisme fongique à l'anoxie. Des protéines impliquées dans la synthèse de l'hème, telles que la 5-aminolevulinate synthase (ALV-1) et la coproporphyrinogen-III oxidase CPO étaient plus abondantes sous condition anoxique que sous condition normoxique, et également fortement enrichies lors de la chromatographie d'affinité avec les formes monocystéiniques de Trx, suggérant une connection entre les réponses redox et anoxique. Les essais biochimiques ont confirmé que CPO est une protéine cible de Trx. CPO forme des dimères médiés par des ponts disulfure, réversibles par action de la Trx mais non par action de la glutaredoxine. Nos résultats soulignent l'ampleur du rôle régulateur du système Trx chez N. crassa, dans la signalisation redox, l'expression de cellulases et la réponse à l'anoxie. Ces connaissances permettront de caractériser les mécanismes moléculaires de régulations redox essentielles à l'adaptabilité fongique et à la dégradation de la biomasse.
Thesis resume
The thioredoxin (Trx) system is a fundamental component of the cellular machinery that maintains redox homeostasis across all domains of life. In yeast, thioredoxins, thioredoxin reductases and NADPH facilitate thiol-disulfide exchange reactions and thereby regulate the redox state of cysteine residues in target proteins. These post-translational modifications may impact the function of the target proteins, and regulate signaling pathways and stress responses.
The saprophytic fungus Neurospora crassa, a model organism for studying fungal biology, offers an excellent model for investigating the interplay between redox regulation and metabolic adaptation in filamentous fungi, particularly under conditions that induce plant cell wall degradation. However, the N. crassa Trx system, its protein targets and its role in regulating plant cell wall degradation mechanisms remain little explored.
In this thesis, we have identified three Trx and one TRR that make up the N. crassa Trx system by bioinformatic analyses. Compared to the well-characterized Trx system of Saccharomyces cerevisiae, N. crassa counts with unique features such as a conserved C-terminal extension in TRX-1, which is conserved among two classes of ascomycetes. Surprisingly, we did not identify a mitochondrial thioredoxin reductase (TRR), raising questions about the recycling mechanisms of the mitochondrial Trx. Utilizing affinity chromatography with monocysteinic isoforms of each of the three Trxs and protein extracts from fungi grown under cellulase production-inducing conditions, we identified the set of potential Trx-interacting proteins. Among them, kinases, transcription factors, chitin synthases, as well as proteins related to oxidative stress and cellulase regulation showed a high enrichment during chromatography. Notably, transcription factors like CLR-1 and kinases such as OS-1, a component of the OS-2 MAPK pathway, were identified. Structural modeling and biochemical assays of CLR-1revealed cysteines involved in intermolecular disulfide bridge formation and redox-sensitive multimers, highlighting possible regulatory mechanisms involving intermolecular disulfide bonds.
We also explored the fungal response to anoxia during cellulose degradation, revealing modest but significant proteomic changes in plant cell wall and fungal cell-wall degrading enzymes, indicative of an adaptive response of fungal metabolism and fungal cell wall remodeling. Proteins involved in heme synthesis, such as 5-aminolevulinate synthase (ALV-1) and coproporphyrinogen-III oxidase (CPO), were more abundant under anoxic than normoxic conditions, and were also highly enriched on affinity chromatography with monocysteinic forms of Trx, suggesting an interplay between the redox and the anoxic response. Biochemical assays confirmed CPO as a substrate for Trx but for glutaredoxin. Our results underline the extent of the regulatory role of the Trx system in N. crassa, in redox signaling, cellulase expression and responses to anoxia. This knew knowledge will help characterize the molecular mechanisms of redox regulation, essential to fungal adaptability and biomass degradation.