Soutenance de thèse de Anna NOTARO

The sujet de cette these portait sur la caractérisation de la machinerie originale utilisée par les Mimiviridae pour glycosyler les fibrilles entourant leurs capsides en travaillant sur les prototypes des 3 lignées connues, Mimivirus (A), Megavirus chilensis (B) et Moumouvirus australensis (C). Les Mimiviridae infectant les amibes présentent des capsides couronnées de fibrilles très glycosylées de longueurs variables en fonction des lignées virales. De manière surprenante, ce sont des protéines virales qui sont responsables de la glycosylation des fibrilles. L’analyse de ces fibrilles a révélé que les sucres majoritaires étaient du Rha, GlcNAc et VioNAc pour Mimivirus, and GlcNAc and RhaNAc pour Megavirus chilensis. A ce jour, on ne connaissait pas la composition en sucres des fibrilles des virus de la lignée B. Au cours de cette thèse, nous avons étudié la machinerie de glycosylation de ces virus géants en combinant différentes approches : la chimie des carbohydrate, la bioinformatique et la biochimie des protéines. La chimie des carbohydrate a permis de déterminer la composition en glycans associés aux fibrilles virales et d’en résoudre les structures. Les fibrilles de Mimivirus sont décorées par 2 polysaccharides différents, poly-1 et poly-2. Poly-1 est caractérisé par la répétition d’un disaccaride linéaire fait de 3)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→, avec un pyruvate branché en position 4,6 du GlcNAc. Poly-2 présente une unité répétée branchée de séquence 2)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ pour le squelette linéaire et du rhamnose branché en position 3 par de la viosamine méthylée en position 2 et acétylée en position 4. Ces structures originales n’existent pas dans le monde eucaryote, tandis que certains de leurs composants ont déjà été identαifiés dans le monde bactérien. Megavirus chilensis présente une composition en sucres différente. Ses fibrilles plus courtes sont composées en majorité de N-acetylglucosamine, N-acetylrhamnosamine and N-acetylquinovosamine. Après purification, il semble que les fibrilles de Megavirus sont fait de plus d’un type de polysaccharide, l’un ayant présentant un trisaccharide de RhaNAc : α-L-4OMe-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→. L’analyse préliminaire des fibrilles de Moumouvirus révèle la présence de glucosamine et quinovosamine qui décorent les fibrilles et un sucre rare, la bacillosamine. A partir de ces données expérimentales il devenait possible de rechercher de nouveaux gènes responsables de ces glycosylations spécifiques. Ainsi, le cluster de 9 gènes déjà publié de Mimivirus a pu être étendu à 13 gènes. Un cluster de 14 gènes a été d’autre part identifié dans le génome de Moumouvirus australensis, le premier cluster de gènes de la glycosylation identifié dans la lignée B. La comparaison des gènes de glycosylation des Mimiviridae renforce le fait que la glycosylation des fibrilles soit lignée spécifiques. Cependant, Moumouvirus australensis reste une exception avec un cluster de gènes de glycosylation absent des autres membres de la lignée B. Parmi les gènes de glycosylation, l’analyse fonctionnelle in vitro de la protéine L142 a permis de démontrer qu’il s’agit d’une N-acétyltransferase qui acétyle le groupement amino 4 de la viosamine, le sucre rare composant les fibrilles de Mimivirus. N-L142 est ainsi la première N-acétyltransferase virale identifiée. En conclusion, les fibrilles des Mimiviridae sont lourdement glycosylées and le type de sucres et leur organisation dépend de la lignée considérée. La majorité des gènes responsables de la production de ces sucres, de leur modification ainsi que les glycosyltrasnférases impliquées ont pu être identifiées, argument fort en faveur de l’autonomie de ces virus par rapport à leur hôte cellulaire dans la glycosylation de leurs fibrilles.

The aim of this thesis is the study of the innovative glycosylation machinery of the Mimiviridae family, using Mimivirus, Moumouvirus australensis and Megavirus chilensis as prototypes of lineages A, B and C, respectively. Mimiviruses exhibit heavily glycosylated fibrils surrounding their capsid that differ in length depending on the lineages. Surprisingly, it was evidenced that they encode the proteins involved in their fibrils glycosylation. The glycosylation of the fibrils was confirmed by the analysis of their sugar content, revealing that the major saccharide components were rhamnose, N-acetylglucosamine, and viosamine for Mimivirus and N-acetylglucosamine and N-acetylrhamnosamine for Megavirus chilensis. Until now, we lack information on the sugar composition of fibrils from members of the B lineage. In this thesis, the innovative glycosylation machinery of these giant DNA viruses was investigated combining three different strategies: carbohydrate chemistry, bioinformatic and biochemical methodologies. The carbohydrate chemistry methodologies allowed to elucidate the structures/composition of the glycans associated to the giant DNA viruses fibrils. Mimivirus fibrils are decorated with two distinct polysaccharides, called poly_1 and poly_2. Poly_1 is characterized by a linear disaccharide repeating unit made of 3)-α-L-Rha-(1→3)-α-D-GlcNAc-(1→, with a pyruvic acid branched at position 4,6 of GlcNAc. Poly_2 has a branched repeating unit with the sequence 2)-α-L-Rha-(1→3)-β-D-GlcNAc-(1→ in the linear backbone and rhamnose further branched at position 3 by viosamine methylated at position 2 and acetylated at position 4. Regarding the novelty of the identified structures, they have no equivalent in eukaryotes, while some components were reported in bacteria. Megavirus chilensis has a different sugar composition of its shorter fibrils, with N-acetylglucosamine, N-acetylrhamnosamine and N-acetylquinovosamine as major components. Purification results suggested that Megavirus fibrils were decorated by more than one polysaccharides/oligosaccharide species, one having this trisaccharide: α-L-4OMe-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→3)-α-L-RhaNAc-(1→. A preliminary analysis revealed that Moumouvirus australensis fibrils were decorated with glucosamine and quinovosamine in addition to the rare sugar, bacillosamine. Starting from this experimental data, it was possible to identify new genes involved in glycosylation. As a result, the published nine-gene cluster of Mimivirus was extended to thirteen genes. A different cluster of fourteen genes was identified in Moumouvirus australensis, representing the first glycosylation gene cluster identified for the B lineage. A comparison of the glycosylation genes in the Mimiviridae family reinforced our finding that fibrils glycosylation was lineage specific. However, Moumouvirus australensis is an exception as it exhibits a cluster of glycosylation genes that is missing in other member of the B lineage. Among the genes with the glycosylation cluster, the function of L142 was investigated in vitro, demonstrating that it is a N-acetyltransferase that acetylates the 4-amino group of viosamine. N-L142 represents the first virally encoded N-acetyltransferase. To conclude, the fibrils of Mimiviridae are heavily glycosylated and the type of sugars and their organization depends on their lineage. The majority of the genes responsible for sugar production, sugar modification and glycosyltransferases were identified, strongly suggesting that Mimiviridae are autonomous for their fibrils glycosylation.