Soutenance de thèse de JANS-ROBINSON Nicolas

Résumé de la thèse

L'uranium est un radionucléide naturellement retrouvé dans l'environnement, mais également à la suite d'activités humaines (cycle du nucléaire, exploitation minière, utilisation d'engrais et d'armement). La forme la plus stable de l'uranium en solution aqueuse est le cation uranyle UO22+. Il peut être chélaté par divers ions et protéines et peut affecter la santé de nombreux organismes, dont l'homme. La concentration maximale d'uranium établie par l'OMS dans l'eau potable est de 30 μg/L. Par conséquent, la surveillance environnementale est un domaine de recherche essentiel, tant du point de vue environnemental que sanitaire. Les techniques utilisées aujourd'hui pour la détection de l'uranium en solution aqueuse mesurent la concentration totale de l'uranium, qui diffère de sa fraction biodisponible, définie comme la quantité capable de pénétrer dans un organisme vivant. Il n'existe actuellement aucun système capable de détecter la fraction biodisponible de l'uranium, qui est estimée par des approches théoriques. Les biosenseurs, définis comme des « instruments analytiques combinant une composante biologique et une composante physico-chimique », constituent une alternative aux méthodes de détection habituelles. Parmi les différents types de biosenseurs, les biosenseurs « cellule entière » peuvent détecter la fraction biodisponible d'un composé. Un biosenseur d'uranyle (SF1) inspiré d'un biosenseur de calcium a été développé au sein de l'équipe, l'IPM. Il est constitué d'une calmoduline modifiée pour fixer l'uranyle fusionnée à deux protéines fluorescentes (FP) et peut détecter des concentrations micromolaires d'uranyle de façon ratiométrique par une approche de transfert de fluorescence (FRET) entre les deux FP.
Au cours de ce projet, nous avons cherché à exprimer ce biosenseur chez le poisson zèbre Danio rerio, dans l'optique de développer un outil capable de détecter l'uranium biodisponible dans l'eau par une approche d'édition du génome en ciblant trois gènes, sans succès. Par ailleurs, nous avons cherché à améliorer l'affinité du biosenseur SF1 pour l'uranyle. Pour ce faire, nous avons d'une part travaillé à l'expression du biosenseur SF1 au niveau de la membrane externe d'E. coli dans l'optique de développer une méthode de criblage à haut débit. La protéine a bien été exprimée au niveau de la membrane mais il persiste une variabilité en réponse à l'uranyle à optimiser pour développer un crible fiable associé. D'autre part, nous avons amélioré l'affinité du site II de la CaM pour l'uranyle par la modification des résidus en position 2 et 3 suivie du criblage des mutants produits. Ces travaux ont permis d'identifier des variants de la CaM présentant une affinité pour l'uranyle améliorée par rapport à la protéine de départ. Ces résultats ont permis à l'équipe de générer les biosenseurs correspondants et leur caractérisation a mis en évidence une réponse améliorée en termes d'amplitude de signal et de sensibilité.