Soutenance de thèse de Lara EL BAZZAL

Les Neuropathies Périphériques Héréditaires (IPNs) constituent l’une des causes les plus fréquentes de maladies neurologiques héréditaires. Parmi elles, la maladie de Charcot-Marie-Tooth (CMT), constitue le groupe plus large. Durant ma thèse, j’ai étudié les bases physiopathologiques de deux formes d’IPNs: i) CMT4H, une forme rare de CMT démyélinisante, à transmission autosomique récessive (AR), due à des mutations dans le gène FGD4 codant FRABIN, une RhoGEF spécifique des petites RhoGTPases Cdc42 et Rac1 et ii) une forme motrice de CMT à transmission AR, associée à une atteinte centrale, due à des mutations dans VRK1. -Pour CMT4H, mon projet s’est orienté selon deux axes: i) identification de partenaires de FRABIN dans le système nerveux périphérique et ii) étude du rôle de FRABIN dans la myélinisation dans un modèle in vitro de co-culture de neurones sensitifs des DRG (Dorsal Root Ganglion) et des cellules de Schwann (SCs) issus d’un modèle murin d’ablation conditionnelle de Frabin dans les SCs (fgd4SC-/-). Dans un premier temps, j’ai validé trois partenaires de FRABIN impliqués dans la voie du trafic vésiculaire: SNX3 et KIF1A préalablement identifiés par des expériences de double hybride, et DNM2. Concernant le deuxième axe, j’ai détecté des défauts majeurs de myélinisation, de type « hypermyélinisation », dans les co-cultures fgd4SC-/-, évoquant ceux retrouvés dans les biopsies de nerfs de patients atteints de CMT4H. L’étude de ce modèle m’a permis de mettre en évidence une dérégulation de la voie NRG1 type III/PI3K/AKT, activatrice de la myélinisation et un défaut de l’endocytose à l’origine des anomalies observées. J’’ai pu corriger ces défauts en ciblant la voie NRG1 type III, par la niacine, un médicament approuvé par la FDA connu pour inhiber la myélinisation, ouvrant ainsi le champ des perspectives thérapeutiques pour cette maladie. -Dans le cadre du deuxième projet, un séquençage de l’exome entier chez deux patients d’une famille d’origine libanaise atteints d’une forme axonale de CMT à prédominance motrice et associée à une atteinte centrale, a permis d’identifier deux nouvelles mutations hétérozygotes composites dans le gène VRK1, qui code une protéine kinase nucléaire. Des mutations dans VRK1 ont été décrites dans plusieurs maladies neurologiques, affectant les motoneurones. Dans les cellules de patients, j’ai démontré une diminution de l’expression de VRK1, due à une dégradation post-traductionnelle des formes mutées par le protéasome. J’ai également mis en évidence une délocalisation de VRK1 vers le cytoplasme dans les fibroblastes de patients, entrainant une déstabilisation de coilin, une des cibles nucléaires de phosphorylation de VRK1. Coilin est la protéine majeure de structures nucléaires appelées « Cajal Bodies (CBs) », particulièrement importants dans la transcription et l’épissage dans les cellules post-mitotiques comme les neurones. J’ai démontré que la diminution de la quantité de VRK1 dans des motoneurones de la patiente, obtenus par différenciation de cellules souches pluripotentes induites, entraine une désintégration des CBs, qui semble être la cause de défauts de pousse axonale et de branchements observés dans ces motoneurones.

Inherited Peripheral Neuropathies (IPNs) are one the most common causes of inherited neurological diseases. Among them, Charcot-Marie-Tooth disease (CMT) or Hereditary Motor and Sensory Neuropathies (HMSN), forms the largest group. During my thesis, I have studied pathophysiological bases of two forms of IPNs: i) CMT4H, a rare form of autosomal recessive (AR) demyelinating CMT, due to mutations in FGD4 encoding FRABIN, a RhoGEF specific for the small RhoGTPases Cdc42 and Rac1; and ii) an autosomal recessive distal Hereditary Motor Neuropathy associated to upper motor neurons signs, due to mutations in VRK1. -The CMT4H project focused on two axes: i) identification of FRABIN partners in the peripheral nervous system and ii) study of the role of FRABIN in myelination in an in vitro myelination model based on the co-culture of DRG (Dorsal Root Ganglion) sensory neurons and Schwann cells (SCs) from a conditional Knock-Out (KO) mouse model, with specific inactivation of fgd4 in SCs (fgd4SC-/-). First, I validated three partners of FRABIN involved in the vesicular trafficking pathway: SNX3 and KIF1A previously identified by Yeast Two Hybrid experiments, and DNM2. Regarding the second axis, I detected major myelin abnormalities in fgd4SC-/- co-cultures, evoking the myelin outfoldings observed in CMT4H patients' nerves biopsies. Studying this model allowed me to detect an upregulation of the NRG1 type III/PI3K/AKT pathway, which positively regulates myelination; and signs of impaired endocytosis, which presumably lead to the observed anomalies. I was able to correct these defects by targeting the NRG1 type III pathway with niacin, a FDA approved drug, known to downregulate NRG1-III signaling. Concerning the second axis of my project, we have identified, by Whole Exome Sequencing two new compound heterozygous mutations in VRK1, in two siblings from a Lebanese family affected with distal Hereditary Motor Neuropathy associated to upper motor neurons signs. VRK1 is a nuclear kinase for which mutations have been described in several motor neurons diseases. Here, I demonstrated, in patients’ cells, a decrease in VRK1 expression, due to post-translational proteasome-dependent degradation of the mutant VRK1. I have also demonstrated the mislocalization of VRK1, which shifts from nucleus to the cytoplasm in patients’ fibroblasts, leading to destabilization of coilin, one of VRK1 nuclear phosphorylation targets. Coilin is a key component of "Cajal Bodies (CBs)" which are nuclear organelles playing an important role in transcription and splicing in post-mitotic cells such as neurons. I have demonstrated that the decrease in VRK1 levels in the patient's induced Pluripotent Stem Cells derived motor neurons leads to CBs disassembly, and probably axonal growth and branching defects in the patient’s MN. In conclusion, we have shown that VRK1 is a crucial protein in maintaining CBs integrity in motor neurons and might be a key factor in pathophysiology of lower and/or upper motor neuron diseases. Targeting VRK1 in motor neuron diseases might open up new research areas for therapy of these diseases.