Soutenance de thèse de Erika BOULANT

Dans l’objectif de produire des composés à haute valeur ajoutée à partir de déchets agricoles de seconde génération, et dans un souci de répondre aux critères écologiques, les industriels se tournent peu à peu vers la chimie verte. Cependant, la balance entre coût et niveau de production n'est que rarement compatible avec les exigences économiques de rentabilité. En effet, une production élevée d’un composé exogène à l’intérieur d’une cellule hôte n’est pas sans conséquences. Les molécules surproduites deviennent rapidement toxiques pour la cellule et entrainent des interférences dans les processus physiologiques, déstabilisent l’enveloppe, épuisent l’hôte, … contraignant ainsi la cellule à une rétro-inhibition de sa production pour sa survie. L’ingénierie de la tolérance est un élément crucial dans la production à grande échelle. En assumant que le gain de tolérance soit synonyme d’une diminution intracellulaire en composé néo-synthétisé et puisse être associée au phénomène de résistance aux antibiotiques conféré par des transporteurs, nous nous sommes focalisés sur les pompes d’efflux. L’objectif de cette thèse est de permettre une détoxification d’un composé intracellulaire par efflux. L’hôte choisit pour cette étude est un nouvel organisme modèle, Deinococcus geothermalis. Cette bactérie non pathogène présente pour notre stratégie d’étude de nombreux avantages, tels que sa capacité à survivre dans des environnements hostiles, sa capacité de dégradation de la biomasse et sa plasticité génomique. Chez les Déinocoques, les pompes d’efflux constitutives n'ayant pas encore été caractérisées et la structure de son enveloppe étant unique en son genre, nous avons cloné un important panel de pompes d’efflux hétérologues de différents types, définies pour exporter différents composés d’intérêts. Nous avons montré que le clonage chromosomique de pompes d’efflux hétérologues dans le génome de D. geothermalis était possible. La seconde étape a été de déterminer parmi les clones recombinants ayant intégré les constructions, leur susceptibilité vis à vis des antibiotiques (substrats bien connus des pompes d’efflux). Un certain nombre de recombinants présentant une tolérance plus élevée que la souche sauvage à plusieurs antibiotiques ont été sélectionnés. L'étape suivante a été de vérifier que le gain de tolérance observé était dû à l’insertion dans l’enveloppe bactérienne d’une pompe d’efflux fonctionnelle. Pour ce faire, des tests d’efflux d’un colorant fluorescent, le composé Hoechst 33342 et d’un antibiotique fluorescent ont été réalisés. Nous avons réussi à démontrer qu’une pompe d’efflux peut être exprimée de manière constitutive et qu'elle permet un niveau d’efflux significativement plus élevé en antibiotique. Ces travaux sont le fruit d’une collaboration entre la société DEINOVE, spécialisée dans l’ingénierie génétique, métabolique et fermentaire de bactéries atypiques, et le laboratoire de recherche académique UMR-MD1 INSERM U1261, spécialisé dans la compréhension des mécanismes d’efflux chez des bactéries pathogènes.

With the aim of producing high value-added compounds from second-generation agricultural waste, and to meet the ecological criteria, industrials are gradually turning towards green chemistry. However, the balance between cost and production level is only rarely compatible with the economic requirements of profitability. Indeed, high production of an exogenous compound within a host cell is not without consequences. The overproduced molecules quickly become toxic to the cell and cause interference in physiological processes, destabilize the envelope, exhaust the host, ... thus forcing the cell to a retro-inhibition of its production for its survival. The engineering of tolerance is thus a crucial element in large-scale production. If the gain in tolerance is synonymous with an intracellular decrease in neo-synthesized compound and can be associated with the phenomenon of antibiotic resistance conferred by carriers, we focused on the efflux pumps. The objective of this thesis is to allow detoxification of an intracellular compound by efflux. The host chosen for this study is a new model organism, Deinococcus geothermalis. This non-pathogenic bacterium has many advantages for our study strategy, such as its ability to survive in hostile environments, its ability to degrade biomass and its genomic plasticity. In the Deinococci, the constituent efflux pumps have not yet been characterized and the structure of its envelope is unique, we have thus cloned a large panel of heterologous efflux pumps of different types, defined to export various compounds interest. We have shown that chromosomal cloning of heterologous efflux pumps into the genome of D. geothermalis was possible. The second step was to determine among the recombinant clones having integrated the constructions, their susceptibility with respect to antibiotics (well-known substrates of efflux pumps). Several recombinants with higher tolerance than the wild-type strain for several antibiotics were selected. The next step was to verify that the tolerance gain observed was due to the insertion into the bacterial envelope of a functional efflux pump. For this purpose, efflux tests of a fluorescent dye, the Hoechst 33342 compound and a fluorescent antibiotic were performed. We have successfully demonstrated that an efflux pump can be constitutively expressed and allows a significantly higher level of efflux of antibiotics. This work is the result of a collaboration between the company DEINOVE, specialized in the genetic, metabolic and fermentative engineering of atypical bacteria, and the academic research laboratory UMR-MD1 INSERM U1261, specialized in the understanding of efflux mechanisms in pathogenic bacteria.