Soutenance de thèse de THI HONG VAN NGUYEN

Dans mon travail de thèse, je me suis intéressé à comprendre les mécanismes de protection des génomes par les nucléoprotéines virales de Coronavirus et d’Arénavirus ainsi qu’au développement d'inhibiteurs contre les nucléases de Mammarenavirus. Mes modèles d’études ont ainsi été la nucléoprotéine du MERS-CoV et celle de Mopeia virus. Les deux jouent un rôle important dans la protection du génome viral, l'assemblage et le bourgeonnement viraux, l'arrêt de la traduction de l'hôte et l'interférence du système immunitaire de l'hôte. En plus de l’action «passive» de masquer les ARN viraux aux senseurs de l’immunité innée la NP d'Arenavirus agit comme un antagoniste de l'interféron par l’action d’une exonucléase (Exo-NP) situé en C-terminal de la protéine. Cette Exo-NP appartient à la famille DEDDh et est spécifique de la dégradation des ARN double brins marqueur de l’infection virale. Cette action est complétée par l’endonucléase (Endo) situé en N-Terminal de la protéine L, une protéine multi-domaines portant les activités de recrutement des ARNm hote, de vol de coiffe, et de la réplication/transcription. Ainsi, l’ Endo est responsable du vol de la coiffe de l'ARNm de l'hôte et de son transfère en tant qu'amorce pour la synthèse d'ARNm viral. Pour ces raisons critiques, je travaille sur la nucléoprotéine du MERS-CoV (ssRNA positif) et des arénavirus (ssRNA négatifs) afin de découvrir les connaissances du NP des ssRNAs. Tout d'abord, je présente une structure cristalline à haute résolution de CTD de nucléoprotéine MERS-CoV. Afin de de l’étudier et de le comparer aux autres domaines de la même famille afin de déterminer les éléments structuraux fondamentaux de conservation qui peuvent nous amener à une meilleur compréhension au mécanisme d’assemblage de nucléoprotéine de coronavirus. Deuxièmement, j'ai contribué à la caractérisation de plusieurs molécules développé au laboratoire ciblant les activités Nucléase des Arenavirus. J’ai utilisé la chimiothèque développé et synthétisé au laboratoire par l’équipe de chimie. Nous avons d’abord effectué un criblage virtuel sur les différentes Nucléases : 4 Exo-NP différents des arénavirus: MOPV, LASV, LCMV et TCRV. Sur la base de la valeur énergétique et du score de géométrie, j’ai organisé et sélectionné les meilleurs candidats afin de tester leur capacité à inhiber l’activité, ou leur capacité de fixation. J’ai pu identifier plusieurs molécules et caractériser leurs valeurs d’ IC50 sur l'enzyme Exo-NP du MOPV. Une molécule a été testée sur le test cellulaire sur les cellules Vero E6 et Huh7. Les trois candidats capables seront choisis pour faire des co-cristallisations des complexes comprenant des inhibiteurs, 2 enzymes (Exo-NP de MOPV, Endo de LCMV) et ion métallique. Ensuite, je montre trois structures de MOPV: une structure d'Exo-NP et de l'ion Mn2+, 2 structures complexes d'Exo-NP et de l'ion Mn2+ après trempage avec un bon inhibiteur. Mon travail de doctorat a ainsi contribué d’une part à la meilleurs compréhension du mode d’assemblage des nucléoprotéines de coronavirus, en particuliers de la présence d’un mécanisme universel de clip et ce malgrès une faible conservation de séquence. Je contribue également au développement de molécules qui vont conduire aux optimisations d’inhibiteurs contre les arénavirus.

In my PhD work, I have focused on the Structural characterization of C-terminal domain MERS-CoV Nucleoprotein and Development of inhibitors against Mammarenavirus nucleases. My studied models are the nucleoprotein of MERS-CoV and of Mopeia virus. Both NPs play an important role in protecting the viral genome, viral assembly and budding, stopping host translation, and interfering with the host immune system. In addition to the "passive" action of masking viral RNAs with sensors of innate immunity, the Arenavirus NP acts as an interferon antagonist by the action of an exonuclease (Exo-NP) located at the C-terminal protein. This Exo-NP belongs to the DEDDh family and is specific for the degradation of double-stranded RNA which is a marker for viral infection. This action is complemented by the endonuclease domain (Endo) located in the N-Terminal of the L protein, a multi-domain protein carrying the activities of host mRNA recovery, cap snatching, and viral replication/transcription. Thus, Endo is responsible snatch the cap structure from host mRNA and to transfer them as primers for viral mRNA synthesis. For these critical reasons, I am working on the nucleoprotein of MERS-CoV (positive ssRNA) and arenaviruses (negative ssRNAs) in order to discover the NP knowledge of ssRNAs. Firstly, I have presentd a high resolution crystal structure of CTD of MERS-CoV nucleoprotein. The purpose is to compare it with other domains of the same family, then, to determine the fundamental structural elements of conservation which can lead us to a better understanding of the assembly mechanism of coronavirus NP. Secondly, I have contributed to the characterization of several molecules developed in the laboratory targeting the Nuclease activities of Arenaviruses. I have used the homemade library synthesized in the laboratory by the chemistry team and another Drug-like chemical Diverse-Library to perform virtual screening/virtual docking for 4 different Exo-NP of the Arenaviruses: MOPV, LASV, LCMV and TCRV; and the Endo of LCMV. Based on the energy value and geometry score, I selected the best candidates to test their abilities to inhibit activity, or their binding capacities. I was able to identify several molecules and characterize their IC50 values on the Exo-NP enzyme of MOPV as well as to carry out structural characterization. A molecule was tested the cellular assay on the Vero E6 and Huh7 cells. The three capable candidates will be chosen to make co-crystallizations of the complexes including inhibitors, 2 enzymes (Exo-NP of MOPV, Endo domain of LCMV) and metallic ion. Then, I show three structures of MOPV: a structure of Exo-NP and ion Mn2+, 2 complex structures of Exo-NP and ion Mn2+ after soaking with a good inhibitor. My PhD work has contributed to a better understanding of the mode of assembly from coronavirus NPs, in particular, the presence of a clipping mechanism despite of the poor conservation of sequence. I also contribute to the development of molecules which will lead to the optimization of inhibitors against arenaviruses.